基于内含肽的模块化嵌合抗原受体平台实现CD19/CD20特异性协同靶向

本综述系统介绍了CARtein这一创新型模块化CAR-T平台，该平台利用内含肽（intein）介导的蛋白反式剪接技术，将通用信号骨架（IntStem CAR）与特异性scFv识别模块（scFvIRM）进行共价连接，成功实现了CD19/CD20双抗原的协同靶向。研究通过体外实验验证了该平台能有效激活T细胞（NFAT/NFκB通路及CD69上调），并证实其在原发性T细胞中具备剪接功能，为克服B细胞恶性肿瘤治疗中的抗原逃逸和肿瘤异质性难题提供了新颖的解决方案。

　　

1 引言

血液系统恶性肿瘤是一组起源于骨髓和淋巴系统的异质性增殖性疾病，多数预后较差。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法的突破为这类肿瘤（特别是B细胞肿瘤）的治疗带来了重大进展。CD19抗原已成为CAR-T细胞的主要靶点，是急性淋巴细胞白血病（ALL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）的重要生物标志物。然而，部分患者在接受CAR-T治疗后仍会复发，原因常包括CAR-T细胞持久性不佳或靶细胞膜上CD19抗原的下调或缺失。

为克服抗原逃逸导致的治疗失败，双靶向策略被提出，即使其中一个抗原丢失，效应细胞仍能识别白血病/淋巴瘤B细胞。CD19/CD22双靶点已在临床试验中展现出良好效果。近年来，CD19/CD20双靶点作为预防CD19缺失所致复发的候选方案日益受到关注，因为CD20靶点在CD19阴性ALL病例中已显示疗效。CD20表达水平因疾病和患者特异性条件而异，较高水平与较好预后相关，而CD20缺失则与较差生存率相关。

多种策略已被用于靶向多个抗原。最直接的方法是输注两种不同的CAR-T，或在同一细胞中共同转导两种不同的CAR，但这类混合产物存在异质性且生产成本更高。串联CAR构建体含有两个不同的单链可变片段（scFv），每个靶向其各自的同源抗原。多种CD19/CD20串联CAR-T细胞已显示出对恶性B细胞的细胞毒性，但其功能取决于每个scFv相对于T细胞膜的位置，而这又取决于抗原与肿瘤细胞表面的距离。

模块化CAR是一个非常前景的选择，它由一个惰性骨架组成，可溶性或反式表达的scFv可与之结合，允许T细胞通过单一分子靶向多个抗原。迄今为止，这种新技术包括各种替代的适配器/受体组合，如生物素/亲和素、亮氨酸拉链、ULBP2/NKG2D和SpyTag/SpyCatcher。

本研究提出应用蛋白质剪接来利用模块化CAR。所提出的系统利用内含肽（intervening proteins），这些是内部蛋白质片段，通过称为蛋白质剪接的分子反应从较大的前体中自我切割，最终通过新的肽键连接侧翼的外显蛋白结构域。该反应可以发生为顺式剪接（单个分子中内含肽被N端和C端外显蛋白切割），或反式剪接（N端外显蛋白/内含肽片段与另一个蛋白质的C端外显蛋白/内含肽结构域反应）。当这两个部分融合到蛋白质模块的末端时，它们形成一个分裂的蛋白质，经历自我剪接反应，其中内含肽被移除，蛋白质模块连接在一起，留下一个成熟的蛋白质，仅带有有限的6个氨基酸疤痕。这些反应还具有不依赖能量的优点，因此不需要辅助复合物或额外的辅因子。

因此，基于内含肽介导的识别模块与通用CAR信号骨架结合的模块化CAR平台是先前描述的模块化CAR-T细胞的一个有趣替代方案，因为这种相互作用以高度特异性的方式发生，共价结合两个伙伴，使用与蛋白质其余部分无法区分的正常肽连接，并且残留的氨基酸极少。 thus，我们开发了一种新的基于内含肽的模块化CAR系统，以靶向多个抗原，同时减小构建体的整体大小。为此，我们设计并转导了Jurkat细胞，其携带包含惰性细胞外内含肽-Fc结构域的第二代信号CAR骨架（CD28/ζ），该骨架与抗CD19和/或抗CD20 scFv识别域共表达，每个识别域与互补的正交内含肽结合。此外，还测试了针对这两种抗原的串联scFv受体。这种基于内含肽剪接的"CARtein"系统是CAR优化和多抗原靶向的良好候选方案。

2 材料与方法

2.1 CARtein、CD19和CD20表达质粒的构建

通用的内含肽信号模块（IntStem CAR）可结合不同的scFvIRM，其经过密码子优化并由GeneArt?合成。序列从5'到3'编码包括人IgKVIII前导序列、Twin-Strep-tag?（TST）肽、柔性链间连接子（GGGS）₃、IMPDH-1 C端内含肽-外显蛋白结构域，与CD28跨膜和胞质域以及TCR-ζ域框内融合。IntStem CAR编码序列通过LR Gateway?反应克隆到慢病毒穿梭载体pHRSINcPPT CEW中，从而允许其在SFFV启动子下表达。

合成了三种不同的scFvIRM构建体作为IntStem CAR模块的结合伙伴，基于Zah等人描述的抗CD19、抗CD20和串联抗CD19-CD20 scFvIRM。抗CD19 scFv（VL-VH）的CDS后面框内融合了编码IgG₄铰链域、N端内含肽IMPDH.1-N、柔性（GGGS）₂连接子、c-myc和6His标签以及（G₂S）₂A₃-KDEL序列的序列，该序列允许scFvIRM在内含肽反式剪接发生前被隔离在内质网（ER）中。抗CD20 scFvIRM构建体的设计与抗CD19类似，但使用了更长的间隔区，包括铰链-CH₂-CH₃，因为抗CD20 CARs由于CD20靶点靠近肿瘤膜而需要更长的胞外域。此外，还设计了一个CD20（VL-VH）-（GGGS）₄-CD19（VH-VL）串联scFvIRM，仅使用铰链间隔区，因为CD19本身能正确地将抗CD20与膜分离以到达较短的CD20抗原。

对于人CD20抗原的表达，直接包装编码人CD20的慢病毒表达质粒（pJRH-1328 LV EF1a-CD20 IRES-EGFP；Addgene质粒号201918）到慢病毒载体中。对于CD19，为了在不同药物抗性下表达CD19和CD20，我们将CD19编码序列从先前建立的质粒（pJRH-1363 LV EF1a-CD19 IRES-EGFP；Addgene质粒号201919）克隆到pLEX_307中，该质粒允许在嘌呤霉素抗性下强表达CD19。

2.2 细胞系与培养

所有人源细胞系均来自美国模式培养物集存库（ATCC）。为研究T细胞活化，使用了源自Jurkat T JE6.1的细胞亚系Jurkat-TPR。该亚系表达分别由NFκB、NFAT和AP-1启动子控制的荧光蛋白CFP、eGFP和mCherry，先前已用于评估CAR-T细胞活性。人B淋巴瘤细胞系Raji被用作CD19阳性CD20阳性靶细胞。此外，慢性髓系白血病细胞系K562被用作亲本细胞以产生不同的单抗原亚系。最后，人胚胎肾细胞（Lenti-X 293T）用于慢病毒生产。所有细胞在标准DMEM GlutaMAX培养基中于37°C和10% CO₂条件下维持，培养基补充有10% (v/v) FBS、10 mM HEPES、1% (v/v) 丙酮酸钠、100 units·mL^?1 青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和50 μM 2-巯基乙醇，但K562细胞在Iscove's改良杜尔贝科培养基（IMDM）中维持，补充剂与DMEM相同。所有实验均使用无支原体污染的细胞系进行，这些细胞系在过去一年中由Secugen Inc.使用短串联重复（STR）图谱进行认证。

2.3 原代T细胞

外周血样本来自健康捐赠者，遵循知情同意和赫尔辛基宣言。通过密度梯度离心使用淋巴细胞分离培养基分离外周血单核细胞（PBMC）。通过磁性激活细胞分选（MACS）使用CD3特异性微珠从PBMC部分纯化CD3阳性T细胞。纯化的CD3阳性T细胞随后在白细胞介素-2（IL-2，最终浓度50–100 IU·mL^?1）存在下，使用T细胞激活/扩增试剂盒进行激活。所有实验程序均经过安达卢西亚生物医学研究伦理门户（PEIBA）审查，并获得安达卢西亚生物医学研究伦理协调委员会（CCEIBA）批准，许可证号SICEIA-2024-002038。

2.4 慢病毒载体生成

通过将HEK Lenti-XTM 293T细胞与不同的载体质粒、pCMV?R8.91和pMD2.G（VSVG）瞬时共转染来产生慢病毒上清液。细胞在转染前24小时添加到胶原包被的100 mm平板中。第二天，使用聚乙烯亚胺（PEI）介导的转染在OptiMEM?培养基中转染细胞。转染后48和72小时收集上清液，通过离心去除细胞。使用Lenti-X?浓缩剂浓缩慢病毒，并将慢病毒颗粒在-80°C冷冻直至使用。

2.5 细胞转导

通过用相应的慢病毒颗粒转导TPR细胞，并在此后48小时添加40 μg·mL^?1 杀稻瘟素S HCl，产生亲本IntStem CAR-TPR细胞系。通过用Strep-Tactin?XT DY-649染色评估IntStem CAR表达。一旦建立该细胞亚系，将3 × 10⁵ IntStem CAR-TPR细胞等分试样保持未转导或用串联抗CD20-抗CD19-scFvIRM（Tandem CAR）、抗CD19-scFvIRM（CD19 CAR）、抗CD20-scFvIRM（CD20 CAR）或两者（Dual CAR）进行转导。转导后48小时添加0.25 μg·mL^?1 嘌呤霉素。通过用Strep-Tactin?XT DY-649检测TST表达的缺失，以及通过用生物素化山羊抗人IgG抗体重链染色检测IgG间隔区结构域的存在，评估IntStem CAR与不同scFvIRM伙伴之间内含肽反应的效力。还通过用生物素化重组蛋白L染色评估scFv的存在。蛋白L和抗人IgG随后用PE结合链霉亲和素染色。

原代人T细胞在激活后48小时于Retronectin包被的板中进行转导。将慢病毒制剂解冻并重悬于每孔500 μL培养基中，包括需要两种病毒共转导的孔。对于对照孔，添加500 μL培养基。将含有病毒的板在32°C下以2000 g离心1小时以增强病毒吸附。离心后，将1.7 × 10⁶ 激活的T细胞添加到每孔中，最终体积为2 mL完全培养基，并补充适当量的IL-2。然后将病毒和细胞混合物在32°C下以500 g离心5分钟以促进转导。此后，收集细胞并维持培养以进行进一步处理。

转导两周后，通过以5:1的效应器：靶标比率与表达CD19和CD20的辐照Raji细胞共培养来扩增T细胞。使用TrueBEAM直线电子加速器进行30 Gy照射。仅表达信号模块的细胞和未转导的对照用抗CD3和抗CD28激活珠刺激。扩增三天后，收获所有细胞并用蛋白L染色，通过流式细胞术评估成熟CAR表面表达。

用编码CD19或CD20的慢病毒颗粒转导K562细胞，获得表达单个抗原的单独细胞亚系。转导后48小时，向用CD19转导的细胞添加0.25 μg·mL^?1 嘌呤霉素，向用CD20转导的细胞添加100 μg·mL^?1 博来霉素。此外，通过两种抗原的共转导以及随后用嘌呤霉素和博来霉素双重选择获得CD19阳性CD20阳性K562（2Ag-K562）细胞。通过用事先用人FcR封闭试剂在室温下处理15分钟的人抗CD19-PE和CD20-APC单克隆抗体标记，验证所有K562亚系和Raji细胞中CD19和CD20的表达。数据采集在Cytek? Aurora 5L 16UV-16V-14B-10YG-8R光谱流式细胞仪上进行。

2.6 通过光谱流式细胞术进行T细胞活化测定

将效应器CAR-T细胞与Raji细胞在96孔板中以靶标：效应器（T:E）比率1:1、1:5和1:10在5% CO₂和37°C下共培养24小时和48小时。此外，为了测试每个scFv对其同源靶标的特异性，将效应器细胞与WT、CD19阳性、CD20阳性或2Ag K562细胞以靶标：效应器（T:E）比率1:1在5% CO₂和37°C下共培养24小时和48小时。在每种情况下，首先对细胞进行计数并离心，用新鲜补充的DMEM更换消耗的培养基。

对于每次测量，将细胞在冰冷PBS中洗涤两次，并根据制造商的程序用FcR封闭试剂在室温下处理15分钟。然后洗涤细胞并用抗人CD69-APC和CD3-PerCP/Cy5.5抗体标记。为了从分析中排除死细胞和碎片，用Zombie NIR?可固定活力试剂盒在室温下染色15分钟。在Cytek? Aurora 5L 16UV-16V-14B-10YG-8R光谱流式细胞仪上获取数据，并在FlowJo软件V10.1中进行分析。

2.7 统计分析

数据先前使用FlowJo v10.8.1软件进行评估。然后，使用GraphPad Prism v10.0生成统计分析和相应的图表。对于多于两组的比较，使用双向ANOVA，并进行Bonferroni事后检验以确保多重比较的可靠性。为了比较两组之间的差异，进行了双尾未配对Student t检验。值以三次重复的平均值±标准差表示，显著性水平在图中标出（P < 0.05；P < 0.01；P < 0.001）。

3 结果

3.1 CD19-CD20双特异性CARtein系统的开发

为了生成内含肽信号CAR模块（IntStem），我们使用了第二代CD28/ζ CAR，其中包含Twin-Strep-tag?（TST）以便于识别未剪接的受体。为了实现与不同scFv-内含肽识别模块（scFvIRM）的蛋白质剪接，我们在IntStem CAR中包含了C端内含肽，而每个scFvIRM包含正交的N端内含肽。这些scFvIRM在已经表达IntStem的CAR-TPR细胞中表达，以允许在内质网（ER）中发生反式剪接反应，scFvIRM由于KDEL序列而被保留在ER中以防止未剪接模块的分泌。结果，由于识别部分的加入，CARs获得功能性，在scFv和IntStem CAR跨膜结构域（TMD）之间留下一个小的残留物。当它们在TMD上方反应时，它会失去其TST肽，该肽被一个不相关的内含肽肽副产物带走。

该设计允许我们比较抗CD19或抗CD20识别模块，以及在同一IntStem上的抗CD19-CD20串联CARs。由于先前已显示CD19和CD20 CARs中的最佳间隔区长度因其同源抗原与肿瘤细胞膜的不同距离而异，这种方法还允许我们定制不同长度的识别模块，这些模块将组装到共同的IntStem上。由于已知CD19抗原比CD20更远离膜，而CD20是一种多环跨膜蛋白，因此提出CD20-CARs需要在TMD和scFv之间更长的间隔区，为此我们选择了IgG₄ 铰链-CH₂-CH₃。该Fc结构域经过突变以防止与Fc受体相互作用，从而减少脱靶激活风险。另一方面，抗CD19识别模块使用了更短的间隔区版本，仅包括IgG₄ 铰链区。在串联scFv的情况下，还考虑了抗原的相对位置，其中CD20-scFv置于N端，CD19-scFv更靠近铰链-N端内含肽，两者通过柔性连接子连接。通过TST肽的缺失评估反应的效力，预计TST肽将被不同的scFvIRM取代。如图所见，scFvIRM和IntStem共表达有效去除了IntStem CARs上的TST，而scFv可以通过蛋白L在表达Tandem、Dual和CD20-CAR的细胞上检测到。相比之下，所选CD19-scFv序列已知仅能被蛋白L微弱检测到。此外，在表达CD20和Dual CAR的细胞上也检测到来自抗CD20-内含肽构建体的人IgG，但在仅表达CD19或Tandem模块的细胞中未检测到，因为铰链区不包含表位。为了评估每个识别模块对其同源靶标的特异性，用任一种抗原（CD19或CD20）或两者转导K562细胞。因此，测试了四种不同的亚系：K562-野生型（WT）（CD19阴性CD20阴性）、K562-CD19（CD19阳性CD20阴性）、K562-CD20（CD19阴性CD20阳性）和K562-2Ag（CD19阳性CD20阳性）。通过光谱流式细胞术评估了这些抗原在K562以及Raji细胞（CD19阳性CD20阳性）上的表达。

3.2 CARteins针对单个抗原的特异性评估

为了分析该平台的特异性，我们研究了每个CAR-TPR如何对表达CD19、CD20或两者的K562细胞作出反应。通过光谱流式细胞术量化NFAT（eGFP）和NFκB（CFP）报告基因活性以及CD69上调。表达包含特异性scFv的CARs的细胞在与其同源抗原结合时被激活（每个参数在每个时间点P < 0.001），而对其他抗原保持未刺激状态。单scFv CARteins（CD19-和CD20-CARs）的激活在K562-CD19或K562-CD20存在下分别引发高NFAT和NFκB启动子活性及CD69上调（P < 0.001），并且两者在K562-2Ag（CD19阳性CD20阳性）刺激下同样被激活。当与单抗原K562细胞共培养时，Dual CARs的激活低于Tandem CARs，但两者在K562-2Ag刺激下同样被激活。这表明我们平台的优势不仅在于其中一个抗原下调需要替换的情况，也在于两个靶抗原都表达的情况。在这种情况下，当与两种抗原结合时，Dual CARs协同作用，导致更强的激活，如在Raji细胞中观察到的那样。相比之下，Tandem CARs表现出相似的启动子活性和CD69上调，无论CD19、CD20或两者是否存在。此外，当与Raji细胞共培养时，IntStem CAR-TPR细胞不对任何K562细胞亚系或K562-WT细胞作出反应，这加强了它们在缺乏识别模块时作为惰性模块的适用性。

3.3 靶向Raji细胞时CARtein的激活

在评估了对单个抗原的反应后，我们旨在通过靶向Raji细胞来测试CARtein平台的功能性，Raji细胞已被广泛用作CD19阳性CD20阳性伯基特淋巴瘤细胞系模型。将细胞以1:1、1:5和1:10的靶标：效应器比率共培养，并在24小时和48小时后分析激活情况。通过设门单细胞、活CD3阳性细胞将效应器细胞与Raji细胞区分开来。与Raji靶细胞共培养后，工程化Jurkat CAR-TPR细胞的激活通过光谱流式细胞术在标准化的单活细胞CD3+门内进行量化，以确保跨条件的可比分析。

双变量点图显示了24小时和48小时时NFAT–eGFP与NFκB–CFP的关系，突出了抗原刺激后激活一个或两个转录报告基因的细胞。相同时间点早期激活标志物CD69（APC）的直方图显示，在活单细胞CD3+门内，相对于未转导对照，其表达上调。Raji细胞引起NFκB启动子的基础激活和CD69的轻微上调，但与CAR特异性刺激引起的激活相比可忽略不计。有趣的是，与Raji细胞共培养不会在未转导（NT）CAR TPR细胞或仅表达IntStem模块的细胞中诱导NFAT活性，而在受刺激的CAR-TPR细胞中NFAT活性高度上调。正如预期的那样，四种不同的效应器CAR细胞亚系（CD19、CD20、Dual和Tandem CARs）在与Raji靶细胞共培养时被激活，表现为NFAT阳性NFkB阳性应答群体占主导地位以及>90%细胞中CD69的上调。

双向ANOVA分析显示，与未刺激细胞相比，这些增加具有统计学显著性。在刺激Raji细胞24小时后，高NFAT和NFκB启动子激活以及CD69上调是明显的，尽管激活峰值出现在48小时，在NFAT和NFκB启动子激活方面高于24小时（**P < 0.01），但CD69则不然，其在激活细胞中的水平在激活后24小时已经达到顶峰。有趣的是，这种上升趋势在较低的靶标：效应器（T:E）比率下更为明显，在1:10和1:5比率下更高。然而，不同T:E比率之间未观察到总体显著差异，尽管刺激强度往往随着比率增加而略有增加。值得注意的是，在缺乏任何互补scFvIRM结合伙伴的情况下，IntStem CARs不对Raji刺激作出反应，从而证明其惰性性质。在未刺激的IntStem CAR-TPR细胞中，仅观察到基础CD69表达的微弱增加。然而，这些细胞的行为与未转导TPR细胞与Raji细胞共培养时相似，具有零NFAT活性但轻微的非特异性NFκB激活和CD69上调，因此不能仅用IntStem介导的强直信号来解释。

3.4 内含肽剪接发生在原代T细胞中

在验证了模块化CAR平台在Jurkat细胞中的功能性后，我们将实验扩展到原代人T细胞，以评估该系统在临床相关背景下的适用性。从供体PBMC纯化CD3阳性T细胞，并用编码信号模块和抗原识别模块的慢病毒载体进行共转导。如图显示，细胞首先在FSC/SSC上设门以识别T细胞群体，随后进行单细胞鉴别并使用可固定Zombie NIR染料排除非存活事件，然后选择CD3阳性活细胞进行读数。使用蛋白L染色的流式细胞术分析显示，表面表达 exclusively 存在于共转导细胞群体中，表明模块化CAR的成功组装和剪接。相比之下，仅转导信号模块的原代T细胞未检测到蛋白L染色，确认抗原识别模块的递送对于成熟受体的表面表达至关重要。这些发现证实模块化CAR也在原代人T细胞中组装，确认了其用于转化和治疗研究的潜在适用性。

4 讨论

CAR-T细胞疗法在对抗淋巴瘤和白血病（如B-ALL或B-NHL）方面显示出有希望的结果。在这方面，CD19由于其