整合单细胞多组学揭示肉瘤样透明细胞肾癌恶性特征及PREX2-PTEN-PI3K/AKT通路机制

本研究通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq），首次系统揭示了肉瘤样分化透明细胞肾癌（ccRCC with SD）的转录调控特征，发现FOS/JUND等转录因子活性结合特征，鉴定出DST、FRMD4A和PREX2作为新型标志物，并证实PREX2通过抑制PTEN激活PI3K/AKT通路驱动肿瘤进展，为这一罕见肾癌亚型的诊断和治疗提供了新视角。

　　

ABSTRACT

透明细胞肾癌（ccRCC）伴肉瘤样分化（SD）是一种罕见的组织学亚型，以侵袭性临床行为和不良预后为特征。本研究通过对一例肉瘤样ccRCC患者进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）和全外显子组测序（WES）分析，并结合19例经典ccRCC样本（19,819个肿瘤细胞和21,684个细胞核）的数据，首次在单细胞水平揭示了该疾病的恶性特征。

1 Introduction

ccRCC占肾癌病例的70%-80%，其中肉瘤样分化约占1%-8%，但20%以上病例确诊时已为IV期，缺乏有效治疗方案。虽然TCGA项目未单独记录肉瘤样ccRCC的分子特征，但前期研究表明其具有独特的分子发病机制，通常缺乏经典的3p21-25缺失，并表现出独特的突变和转录谱。本研究利用单细胞多组学技术，旨在从细胞和表观遗传水平阐明其恶性特性。

2 Materials and Methods

样本来自广西医科大学第一附属医院接受根治性肾切除术的患者（ID: RCC122），病理确诊为肉瘤样ccRCC。研究使用人RCC细胞系786-O、OS-RC-2和Caki-1进行体外验证。单细胞悬液和单细胞核的分离参照先前方法，scRNA-seq和scATAC-seq cDNA文库构建遵循10X Genomics标准流程。数据分析采用Seurat、DoubletFinder和Signac等R包，CNV分析使用inferCNV工具，RNA速率和细胞轨迹分析使用velocyto和Monocle2。功能实验包括细胞增殖（CCK-8和EdU assay）、迁移（伤口愈合和Transwell assay）和蛋白表达（Western blot）检测，动物实验使用BALB/C裸鼠构建异种移植模型。

3 Results

3.1 Clinical Features of ccRCC With SD

患者为67岁男性，左肾肿瘤伴肺转移，术后病理证实为肉瘤样ccRCC。CT显示左肾肿瘤动脉期强化不明显，病理染色显示肉瘤样分化特征，肺转移灶病理结果同样显示肉瘤样分化。

3.2 Whole-Exome Sequencing Identified the Characteristics of ccRCC With SD

WES分析发现，SNV和INDEL主要发生在内含子、基因间区和CDS区域，错义突变和同义突变是最常见的突变类型。VHL基因未发生突变，但ccRCC常见突变基因（如PBRM1、SETD2、PTEN、SNTG1和MTOR）的突变数量和比例（57.9%）显著升高。这些突变基因的转录组表达水平降低，CA9表达也因错义突变而降低。

3.3 Integration of scRNA-Seq and scATAC-Seq Revealed the Single-Cell Resolution Features of ccRCC With SD

scRNA-seq捕获10,930个细胞，质控后保留6,395个高质量细胞，聚类为12种细胞类型，包括CD8⁺耗竭T细胞、NKT细胞、CD4⁺初始T细胞、B细胞、浆细胞、CD4⁺Treg、ccRCC细胞1、NK细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、增殖性ccRCC细胞、单核细胞和肉瘤样ccRCC细胞。scATAC-seq捕获5,934个细胞核，质控后保留4,393个，聚类为8个表观遗传调控簇。整合分析显示scATAC-seq与scRNA-seq细胞簇高度相关。肿瘤细胞中KRT14、CA9、IGSF21和HPSE2等基因染色质可及性高，非编码RNA如CTB-164N12.1、RP11-267A15.1等也在肉瘤样ccRCC细胞中可及。

3.4 scRNA-Seq Revealed the Subtypes and Molecular Characteristics of Tumor Cells

肿瘤细胞分为三个亚群：ccRCC细胞1（经典表型，高表达NDUFA4L2、CYB5A、CRYAB）、增殖性ccRCC细胞（高表达MKI67、TOP2A）和肉瘤样ccRCC细胞（高表达PAX8）。CNV分析显示肿瘤细胞3号染色体拷贝数丢失显著。GO分析显示ccRCC细胞1富集于发育过程、程序性细胞死亡等，增殖性ccRCC细胞富集于再生和多细胞生物过程调控，而肉瘤样ccRCC细胞则富集于细胞运动和迁移等恶性行为。RNA速率和Monocle2轨迹分析显示ccRCC细胞1为起源，分化为增殖性ccRCC细胞，最终进展为肉瘤样ccRCC细胞。GSTA1、NDUFA4L2、CYB5A、CD24是早期关键基因，MKI67影响过渡期肿瘤细胞发育轨迹。

3.5 Gene Markers for Sarcomatoid ccRCC Were Discovered by scRNA-Seq

与经典ccRCC相比，肉瘤样ccRCC细胞特征基因差异显著，特异性高表达基因包括CA9、PAX8、MME、DST、FRMD4A和PREX2。队列验证显示，DST（敏感性100%，特异性80%）、FRMD4A（敏感性70%，特异性80%）和PREX2（敏感性100%，特异性100%）在肉瘤样ccRCC中表达优异，PREX2敏感性和特异性最高。

3.6 scATAC-Seq Revealed the Epigenetic Regulatory Characteristics of These Marker Genes

基因活性评分显示DST和FRMD4A在肿瘤细胞和免疫细胞（TAM、单核细胞）中活跃调控，而PREX2主要在肿瘤细胞（尤其是肉瘤样ccRCC细胞）中特异性活跃调控。与经典ccRCC相比，肉瘤样ccRCC中PREX2染色质可及性显著增强，其可及序列主要位于外显子编码区。TCGA和GTEx数据分析显示PREX2在ccRCC中表达显著高于正常肾组织，肉瘤样ccRCC队列中其表达进一步升高。

3.7 PREX2 Was a Key Regulatory Gene for ccRCC With SD by Activating the PI3K/AKT Pathway

过表达PREX2的786-O和OS-RC-2细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增强，E-cadherin表达下降，EMT过程促进。机制上，PREX2抑制PTEN表达，激活AKT和pAKT，从而激活PI3K/AKT通路。动物实验证实，过表达PREX2的异种移植瘤生长更快、体积更大，瘤组织中PTEN表达抑制，pAKT表达升高。

3.8 Transcriptional Regulatory Features of ccRCC With SD Were Revealed by scATAC-Seq for the First Time

scATAC-seq鉴定出80种差异转录因子，肉瘤样ccRCC细胞特异性TF包括FOS/JUND、FOSL1/JUN和FOSL2，而经典ccRCC细胞主要与HNF1B、HNF1A和HNF4A相关。TAM主要TF为SPIC和SPIB，T细胞为EST1和ELK4，B细胞和浆细胞为POU2F3、POU2F2和POU2F1家族。TF足迹分析显示肿瘤细胞与免疫细胞结合位点差异显著。

3.9 Characteristics of the Immune Microenvironment Identified by scRNA-Seq

免疫细胞在肉瘤样ccRCC中比例高，T细胞是最丰富的免疫细胞，包括CD8⁺耗竭T细胞、CD4⁺Treg和CD4⁺初始T细胞，其中CD8⁺耗竭T细胞最多。PDCD1在T细胞中普遍表达。CellChat分析显示单核细胞和TAM与其他细胞互作最多，ccRCC细胞1和增殖性ccRCC细胞与免疫细胞（尤其是单核细胞、TAM和CD8⁺耗竭T细胞）密切互作，但肉瘤样ccRCC细胞与免疫细胞互作较弱。关键配体-受体对包括SPP1-CD44、MDK-NCL、MIF-CD74。免疫荧光证实原发灶和肺转移灶中免疫细胞未浸润肉瘤样分化肿瘤细胞区域。

4 Discussion

本研究通过整合多组学技术，首次系统揭示了肉瘤样ccRCC的基因表达和表观遗传调控特征，发现其转录调控以FOS/JUND等为特征，不同于经典ccRCC的HNF家族。鉴定出DST、FRMD4A和PREX2作为新型标志物，其中PREX2敏感性和特异性最优。功能实验证实PREX2通过抑制PTEN激活PI3K/AKT通路，驱动肿瘤进展。免疫微环境分析显示肉瘤样ccRCC细胞与免疫细胞互作较弱，可能与其免疫逃逸有关。研究为这一罕见肾癌亚型的诊断和靶向治疗提供了新的分子依据和潜在靶点。

Author Contributions

Wenhao Lu和Yixuan Liu负责方法学、验证和初稿撰写；Jizhen Cen、Shengzhu Huang、Zheng Wen、Jiaping Li、Xuefang Liang参与方法学；Zengnan Mo、Zheng Lu、Cheng Su提供资源；Zhenyuan Yu为通讯作者，负责概念化、数据管理、形式分析、 funding acquisition、项目管理和论文撰写与编辑。

Ethics Statement

动物实验经广西医科大学动物伦理委员会批准；研究方案经广西医科大学第一附属医院机构审查委员会批准。

Consent

患者已签署知情同意书。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。