鸟类巢穴环境DNA（eDNA）宏条形码技术：揭示高山灌丛生态系统中鸣禽营养生态与生物多样性的创新方法

本综述创新性地利用鸣禽巢穴作为环境DNA（eDNA）富集器，通过宏条形码（metabarcoding）技术解析高山灌丛生态系统中鸟类营养相互作用及生物多样性。研究开发了新型巢穴全样eDNA提取方法，并采用锁核酸（LNA）修饰的阻断寡核苷酸特异性抑制雀形目鸟类扩增，成功将物种检出丰度提升31%。该技术为研究雏鸟食性、寄生虫传播及捕食者识别提供了非侵入性解决方案，突破了传统监测方法的局限性，为生态互作研究和生物多样性监测开辟了新范式。

　　

ABSTRACT

环境DNA（eDNA）采样技术已从水体扩展至土壤、空气及生物源性基质（如花朵、蛛网）。本研究探索鸣禽巢穴eDNA在揭示鸟类营养生态（雏鸟食性、捕食者身份）和本地昆虫多样性方面的潜力。22个巢穴样本来自高山灌丛生态系统的5种新世界雀形目鸟类和2种非雀形目鸣禽，均在捕食事件发生后采集。采用新型全巢eDNA提取方案，并通过交替锁核酸（LNA）设计的阻断寡核苷酸特异性抑制雀形目扩增。结果显示阻断剂高效降低雀形目读数约100%，且未对非雀形目产生共阻断。物种丰富度在读数阈值≥10时提升31%，多数检出物种为昆虫（包括雏鸟潜在猎物和外寄生虫），捕食者检出率达36%。

1 Introduction

eDNA技术已成为野生动物监测的重要工具，其基质类型不断扩展。生物源性基质（如粪便、血液餐、蛛网）能同时提供生态互作信息。鸣禽巢穴是雏鸟食性、寄生和捕食等生态互作的集中发生地，但传统研究方法存在侵入性强、鉴定精度低等局限。Levesque-Beaudin等（2023）首次证明鸣禽巢穴可作为eDNA采样基质。本研究在此基础上开发全巢eDNA提取方法，并设计特异性阻断剂提升稀有物种检出率，同时利用巢穴捕食事件视频验证数据可靠性。

2 Methods

2.1 Study Site

研究位于蒙大拿州西南部Medicine Lodge河谷，属高山灌丛-针叶林交错带，植被以山蒿（Artemisia tridentata vaseyana）、花旗松（Pseudotsuga menziesii）和杜松（Juniperus spp.）为主。

2.2 Nest Monitoring and Collection

通过行为观察和系统搜索发现巢穴，每1-3天监测一次。随机选取巢穴安装摄像设备（4-12小时/次），确认捕食事件后0-16天内采集巢穴样本（平均4天），手套操作后密封冷冻。

2.3 eDNA Extraction

结合大体积土壤eDNA提取和缓冲液过滤技术：巢穴与磷酸钠缓冲液（0.12 mM, pH≈8）震荡20分钟后，经0.2 μm硝化纤维素滤膜过滤，滤膜硅胶干燥后冷冻。DNA提取采用改良DNeasy Blood and Tissue Kit方案，并经PCR抑制剂去除处理。全程在紫外灭菌的预PCR实验室操作。

2.4 Primer Selection and Blocker Design

选用BF1/BR2引物（扩增COI基因356 bp区域），并通过in silico验证其通用性（eDNAssay工具预测扩增概率AP≥0.7）。针对新世界雀形目设计LNA交替修饰的阻断寡核苷酸（16 bp，熔解温度较引物高7°C），中心区域集中错配以最大化阻断效果。

2.5 Metabarcoding

每巢进行阻断/非阻断双重测序。采用两步PCR：首轮扩增添加带接头的引物（四重复混合），阻断反应添加1 μM阻断剂；第二轮添加索引和测序接头。热循环程序采用 touchdown 方案降低非特异性扩增。阳性对照为美洲鳗（Anguilla rostrata）DNA。Illumina MiSeq v2平台进行2×250测序。

2.6 Bioinformatics

使用DADA2流程处理数据：修剪引物序列、质量过滤、去重复、合并正反向读长并去嵌合体。分类鉴定基于MIDORI2数据库（置信度≥80%），未匹配序列经BLAST比对和taxize包补充注释。

2.7 Statistics

采用配对t检验比较阻断前后物种丰富度差异；基于Bray-Curtis相异度的非度量多维标度（NMDS）分析食性差异；通过物种累积曲线评估采样充分性。

3 Results

共检测126个动物物种，涉及9纲21目：昆虫（98种）、鸟类（8种）、哺乳类（6种）、蛛形纲（5种）等。阻断剂使雀形目读长从1,189,276降至5108（效率≈100%），非雀形目读长未受影响。物种丰富度在读数阈值≥10时提升31%（36→47种）。昆虫优势科为夜蛾科（16种）、蝗科（9种）、盲蝽科（9种）和叶蝉科（8种）。

外寄生虫（Protocalliphora sialia, Trypocalliphora braueri）在82%巢穴中检出；捕食者检出率36%（8/22巢），包括束带蛇（Thamnophis sp.）、长尾鼬（Mustela frenata）和黄松花鼠（Tamias amoenus），与视频记录吻合率83%。猛禽类未检出，可能与巢穴接触时间短（平均8秒）有关。

4 Discussion

本研究验证了巢穴eDNA宏条形码技术在生态互作研究中的价值。LNA阻断剂设计策略（Prout等2023）展现高效特异性，中心单碱基错配即可使阻断效率下降90%。但真菌读长占比过高（81%）挤占动物序列空间，建议后续研究针对优势背景物种设计特异性引物或阻断剂。

巢穴eDNA能同时反映雏鸟食性、寄生虫和捕食者信息，但需注意检测物种未必直接来源于消费行为（可能通过食物链间接引入）。鸣禽觅食范围影响eDNA地理溯源精度，但本研究对象领域较小（0.49–4.86 ha）利于本地物种关联。该技术可补充传统调查方法（如陷阱采样、声学监测），在生态学和保护生物学领域具有广泛应用前景。