三种同域分布沙漠蜥蜴的肠道适应性研究：消化道结构、消化酶活性、肠道微生物群与代谢物的比较分析

本研究通过比较三种同域分布的沙漠蜥蜴（Teratoscincus roborowskii, Phrynocephalus axillaris, Eremias roborowskii）的消化道形态、杯状细胞密度、消化酶活性、肠道微生物群（16S rDNA测序）及粪便代谢组学，揭示了食性生态位驱动肠道微生物分化和宿主特异性适应策略。研究发现，杂食性蜥蜴（T. roborowskii和E. roborowskii）胃体和幽门部杯状细胞密度、α-淀粉酶（α-amylase）和纤维素酶（cellulase）活性显著更高，且肠道微生物功能富集于碳水化合物代谢；而食虫性蜥蜴（P. axillaris）则表现出更高的脂肪酶（lipase）活性及脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）等与高脂饮食相关的微生物富集。代谢组学分析进一步证实了食性对代谢通路（如果糖和甘露糖代谢）的调控作用。本研究为极端沙漠环境中动物的肠道微生物与生理适应性提供了多维度见解。

　　

引言

动物与栖息于其体内的微生物之间的关系可被视为一个生态系统，其演化历史与宿主共享。肠道作为微生物定殖最复杂的环境之一，其微生物多样性与丰富度对宿主健康、生理及肠道稳态具有关键作用。宿主的饮食、生理状态和基因型显著影响肠道微生物的多样性，其中饮食是塑造肠道微生物群落结构最重要的影响因素。肠道功能（包括消化酶活性和营养转运速率）必须与动物摄入的食物相一致。消化酶活性是动物消化生理功能的重要指标，食性决定了消化酶活性及肠道菌群的差异定殖。爬行动物是生态和进化上极为显著的类群，其肠道微生物的组成、结构和功能受多种因素影响。本研究以新疆吐鲁番极端干旱沙漠地区稳定分布的三种同域蜥蜴——裸趾疣蜥（Teratoscincus roborowskii）、叶城沙蜥（Phrynocephalus axillaris）和新疆漠虎（Eremias roborowskii）为对象，探究宿主和饮食如何影响肠道微生物和肠道生理，以促进这些蜥蜴对极端沙漠环境的适应。

材料与方法

伦理声明

所有实验和动物操作均遵循新疆农业大学动物福利与伦理委员会批准的研究方案进行。

石蜡切片制备与染色

取5只T. roborowskii、6只P. axillaris和5只E. roborowskii的消化道，保存于5%福尔马林溶液中。取食管、胃贲门、胃体、胃幽门、空肠和直肠的4–5 mm组织样本，经流水冲洗、乙醇-二甲苯系列脱水、石蜡包埋后，用旋转切片机切成6微米厚度。切片进行过碘酸-雪夫（PAS）染色以观察杯状细胞。统计不同部位消化道杯状细胞数量，采用单因素方差分析和Duncan多重比较进行显著性检验，p < 0.05认为有统计学意义。

动物与粪便收集

于2023年8月在吐鲁番地区捕获10只T. roborowskii（Tr）、10只P. axillaris（Pa）和7只E. roborowskii（Er）成体，并采集其栖息地沙样。将所有成体蜥蜴置于塑料饲养箱中，禁食7天，每日用无菌镊子收集粪便。所有样本立即于液氮中速冻，后转移至-80°C冰箱保存。实验结束后将所有蜥蜴放归。

消化酶活性测定

使用相应试剂盒测定胰蛋白酶（trypsin）、脂肪酶（lipase）、α-淀粉酶（α-amylase）和纤维素酶（cellulase）活性。胰蛋白酶催化N-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐（BAPNA）水解为对硝基苯胺，于405 nm测定吸光度增加值；脂肪酶水解对硝基苯酯产生对硝基苯酚，于405 nm测定吸光度；α-淀粉酶水解淀粉产生的还原糖使3,5-二硝基水杨酸（DNS）变为棕红色，于540 nm测定吸光度；纤维素酶水解纤维素产生还原糖，同样于540 nm测定吸光度。酶活性单位分别定义为：每分钟每克组织产生1 nmol对硝基苯胺（胰蛋白酶、脂肪酶）、每分钟每克组织产生1 μg麦芽糖（α-淀粉酶）、每小时每克组织产生1 μg还原糖（纤维素酶）。

DNA提取与PCR扩增

使用粪便DNA提取试剂盒和沙样DNA提取试剂盒提取总细菌DNA。针对16S rDNA靶区域（引物341F/806R）进行PCR扩增。扩增子经2%琼脂糖凝胶评估、纯化后构建测序文库，于Novaseq 6000平台进行2 × 250 bp双端测序。原始数据存入NCBI序列读段档案数据库。

生物信息学分析

使用FASTP过滤原始数据获得高质量清洁读段，FLASH重叠配对读段为原始标签，经去噪、去除嵌合体后获得有效标签。使用UPARSE将清洁标签按≥97%相似度聚类为操作分类单元（OTUs）。利用RDP分类器基于SILVA数据库对代表性OTU序列进行分类学注释。采用VennDiagram、UpSetR包进行物种组成分析；LEfSe软件筛选生物标志物；计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数评估Alpha多样性；基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）；使用PICRUSt2预测京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路功能。

LC-MS代谢组学检测

粪便样本经液氮研磨后，用冷甲醇/乙腈/水（2:2:1, v/v/v）提取，离心取上清，真空离心干燥。采用超高效液相色谱系统（1290 Infinity LC）耦合四极杆飞行时间质谱仪（TripleTOF 6600）进行分析。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm）。正负离子模式下，流动相A为25 mM醋酸铵和25 mM氢氧化铵水溶液，B为乙腈。质谱条件：离子源气体1/2为60，气帘气30，源温度600°C，电喷雾电压±5500 V。原始质谱数据经ProteoWizard MSConvert转换为MzXML文件，XCMS进行峰识别、峰分组及化合物鉴定。

粪便代谢物检测质量控制与数据分析

采用质控样本进行质量控制，主成分分析评估数据可靠性。使用偏最小二乘判别分析可视化样本聚类，结合倍数变化、t检验p值和正交偏最小二乘判别分析变量重要性投影值筛选差异代谢物。利用超几何检验对差异KEGG代谢物进行富集分析。

结果

三种蜥蜴消化道杯状细胞分布密度

PAS染色显示杯状细胞呈红色或紫红色，分布于三种蜥蜴消化道各部位。杯状细胞分布密度存在显著差异，三种蜥蜴幽门部杯状细胞密度均最高。在食管和直肠，E. roborowskii杯状细胞密度最高；贲门部P. axillaris和E. roborowskii密度显著高于T. roborowskii；胃体和幽门部T. roborowskii和E. roborowskii密度显著高于P. axillaris；空肠和直肠杯状细胞密度E. roborowskii显著高于其他两种。

三种蜥蜴消化酶活性

除胰蛋白酶外，脂肪酶、α-淀粉酶和纤维素酶活性在三种蜥蜴间存在显著差异。完全食虫的P. axillaris胰蛋白酶和脂肪酶活性最高；杂食性的T. roborowskii和E. roborowskiiα-淀粉酶和纤维素酶活性显著更高，酶活性顺序为T. roborowskii > E. roborowskii > P. axillaris。

三种蜥蜴肠道微生物群多样性

三种蜥蜴共界定1311个独特OTUs，沙样中922个。T. roborowskii OTUs数最多（948），其中126个独特；P. axillaris共825个OTUs，176个独特；E. roborowskii共806个OTUs，143个独特。Alpha多样性分析显示P. axillaris的Shannon、Simpson、ACE、Chao1指数略高于其他两种，但无显著差异；沙样与三种蜥蜴间Alpha多样性差异显著。PCoA和NMDS图显示各蜥蜴物种及沙样聚类良好，E. roborowskii与其他两种明显分离，T. roborowskii和P. axillaris部分重叠，表明三种蜥蜴肠道微生物多样性和结构存在差异。

三种蜥蜴肠道微生物群相似性与差异性

门水平上，三种蜥蜴肠道微生物群主要以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和疣微菌门（Verrucomicrobia）为主。沙样微生物群主要由厚壁菌门、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门组成。科水平上，主要细菌科为拟杆菌科（Bacteroidaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和阿克曼菌科（Akkermansiaceae）。属水平上，T. roborowskii以拟杆菌属（Bacteroides）、阿克曼菌属（Akkermansia）和埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）为主；P. axillaris以阿克曼菌属、拟杆菌属和副拟杆菌属（Parabacteroides）为主；E. roborowskii以拟杆菌属、阿克曼菌属和副拟杆菌属为主。肠型分析显示所有E. roborowskii和大多数T. roborowskii个体属于肠型1（拟杆菌属），大多数P. axillaris个体属于肠型2（阿克曼菌属）。LEfSe分析显示，P. axillaris中脱硫菌门（Desulfobacterota）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、脱硫弧菌科、芽孢杆菌目（Bacillales）、Planococcaceae、Marinifilaceae和Odoribacter相对丰度显著更高；T. roborowskii中γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、埃希氏菌-志贺氏菌属和Monocercomonoides sp. PA203显著富集；E. roborowskii中假单胞菌目（Pseudomonadales）、拟杆菌科、莫拉克斯菌科（Moraxellaceae）、拟杆菌属和不动杆菌属（Acinetobacter）显著富集。

三种蜥蜴肠道微生物群功能差异

PICRUSt2预测KEGG代谢通路功能显示，与T. roborowskii相比，P. axillaris在二级水平上内分泌系统、心血管疾病和免疫疾病通路显著富集；三级水平上脂肪酸降解、酮体合成与降解及II型聚酮骨架生物合成通路显著富集。与E. roborowskii相比，P. axillaris在二级水平上细胞运动性和神经退行性疾病通路显著富集，而E. roborowskii运输与分解代谢通路显著富集；三级水平上E. roborowskii其他聚糖降解、戊糖和葡萄糖醛酸互变及半乳糖代谢通路显著富集。与T. roborowskii相比，E. roborowskii在二级水平上脂质代谢、运输与分解代谢和内分泌系统通路显著富集；三级水平上亚油酸代谢和新霉素生物合成通路显著富集。

三种蜥蜴粪便代谢物差异分析

PCA显示P. axillaris与其他两种蜥蜴明显分离，T. roborowskii和E. roborowskii部分重叠。PLS-DA进一步揭示三种蜥蜴代谢物存在显著差异。T. roborowskii与P. axillaris间筛选出349种差异代谢物，T. roborowskii与E. roborowskii间145种，P. axillaris与E. roborowskii间360种，三组共享14种。聚类热图显示T. roborowskii和E. roborowskii聚在一起，P. axillaris单独成一簇。KEGG功能预测显示，T. roborowskii与P. axillaris及P. axillaris与E. roborowskii的差异代谢物显著富集于甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、碳代谢、ABC转运蛋白和丙酮酸代谢通路；T. roborowskii与E. roborowskii间差异代谢物显著富集于胆汁分泌和硒化合物代谢通路。此外，三种蜥蜴差异代谢物主要富集于果糖和甘露糖代谢通路，关键差异代谢物L-山梨糖和L-鼠李糖富集于此通路。

肠道微生物群、代谢物与消化酶相关性分析

STA-Sankey网络和Spearman相关分析显示，果糖和甘露糖代谢中的关键差异代谢物L-鼠李糖和L-山梨糖与Breznakia和Ruminococcus呈显著正相关。差异代谢物与差异肠道微生物群相关性热图显示，大多数差异微生物与差异代谢物呈不同程度正负相关。拟杆菌属与植物源代谢物及葡萄糖代谢相关糖类显著相关；Breznakia与植物源代谢物显著相关；Erysipelatoclostridium和Breznakia与α-淀粉酶和纤维素酶活性呈显著正相关；Odoribacter、Bilophila、Desulfovibrio和Methanomassiliicoccus与脂肪酶和胰蛋白酶活性呈正相关。肠道微生物种类组成对饮食变化作出响应，而肠道微生物的代谢产出受膳食成分供应和饮食介导的微生物组成变化的影响。肠道中消化酶对底物的分解也影响代谢物的产生。因此，肠道功能对饮食的适应性响应似乎是肠道微生物、代谢物和消化酶之间相互作用的结果。

讨论

消化道杯状细胞分布密度

三种蜥蜴消化道各区域均存在杯状细胞，胃部杯状细胞分布最多。幽门部杯状细胞密度最高，可能与较厚的肌层促进蠕动，需要更多杯状细胞分泌黏液以助消化有关。T. roborowskii和E. roborowskii幽门部杯状细胞密度显著高于P. axillaris，可能因这两种物种主动取食含硬籽的刺山柑，需要更多黏液分泌以防止机械损伤。直肠杯状细胞增多可能与电解质平衡、粪便形成和润滑有关。胃肠道结构和功能特征可能根据当前功能需求发生改变。

消化酶活性

完全食虫的P. axillaris摄入更多蛋白质和脂肪，表现出显著更高的脂肪酶活性。杂食性物种T. roborowskii和E. roborowskii因食料中包含水果，显示显著更高的α-淀粉酶和纤维素酶活性。支持“适应性调节假说”，即食物中不同底物的浓度特异性调节肠道中相应消化酶的活性。当摄入底物体积增加时，降解该底物的特定消化酶活性也必须增加以维持消化效率。动物可根据食物成分调整其消化和吸收功能以满足营养需求。

肠道微生物组分析

与大多数脊椎动物相似，爬行动物肠道微生物群中的主要细菌门主要为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。三种蜥蜴肠道微生物群中的主要门为厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门。阿克曼菌属被视为健康肠道条件的潜在生物标志物，通过促进肠粘膜屏障修复和调节肠道微生物代谢发挥益生菌作用。三种蜥蜴共存的吐鲁番盆地沙质荒地食物稀缺且同质化，可能导致其肠道中疣微菌门高丰度。科水平上，三种蜥蜴肠道微生物群以拟杆菌科、毛螺菌科、阿克曼菌科和Tannerellaceae为主。这些核心微生物群具有潜在有益功能和高丰度，可能是三种蜥蜴适应极端干旱环境的关键调控因素。LEfSe分析揭示三种蜥蜴物种间肠道微生物相对丰度存在显著差异。P. axillaris肠道中脱硫弧菌属相对丰度显著更高。硫酸盐还原菌产生硫化氢，与慢性结肠疾病和炎症相关。高多酚食物可降低肠道中脱硫弧菌属丰度，而高脂饮食提高小鼠结肠黏膜中硫产生细菌水平。P. axillaris的严格食虫性可能导致其肠道中Planococcaceae丰度显著更高。Odoribacter可产生丁酸盐，减少肠道通透性并抑制炎症反应。其显著富集于P. axillaris可能与其专性食虫饮食相关。E. roborowskii中拟杆菌属丰度显著高于其他两种。拟杆菌属参与多种多糖的转运和降解，其高丰度可能归因于食用刺山柑果实对宿主肠道微生物的有益影响。食性差异、系统发育关系和不同生活方式可能导致三种蜥蜴肠道微生物显著差异。三种蜥蜴的共享环境可能影响其肠道微生物组成。

代谢组学分析

植物源产物如反式-2-羟基肉桂酸、海藻糖、葫芦巴碱和反式-玉米素在T. roborowskii和E. roborowskii中显著富集，可能由于食用刺山柑或其他水果。P. axillaris中尿酸和尿苷5'-二磷酸代谢物水平显著更高，可能因其专性食虫饮食。蛋白质代谢产生嘌呤，进一步代谢产生尿酸。差异代谢物的KEGG富集分析显示，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、ABC转运蛋白、丙酮酸代谢、碳代谢和矿物质吸收通路在T. roborowskii与P. axillaris及E. roborowskii与P. axillaris比较中显著富集。肠道微生物参与氨基酸的合成、发酵及代谢分解。碳代谢是与糖代谢密切相关的最基本代谢过程之一。ABC转运蛋白的高丰度是利用复杂植物材料和转运各种降解产物的基础。三种蜥蜴差异代谢物显著富集于果糖和甘露糖代谢通路，可能因杂食性蜥蜴取食刺山柑和葡萄等水果所致。

相关性分析

STA-Sankey网络显示，果糖和甘露糖代谢中的关键代谢物L-鼠李糖和L-山梨糖与Breznakia和Ruminococcus呈显著正相关。L-鼠李糖是植物细胞壁中合成果胶聚合物和细胞壁糖蛋白所需的构建块，有助于增强机体免疫系统防御。L-山梨糖作为癌症治疗的有吸引力的治疗剂，具有多种抗癌活性。差异代谢物与差异微生物群相关性热图显示，两种杂食性蜥蜴与P. axillaris的比较中相关性趋势一致。这可能因为杂食性蜥蜴通过食用刺山柑等食物，其肠道微生物和代谢物对饮食变化作出响应。这些结果表明饮食促进了蜥蜴肠道微生物和代谢物的分化，更多样化的饮食可能促进宿主健康。相关性热图显示差异微生物与大多数差异代谢物呈不同程度正负相关。拟杆菌属与植物源代谢物及葡萄糖代谢相关糖类显著相关，其首要生物学功能是降解大肠中的生物聚合物，特别是多糖。Breznakia与植物源代谢物显著相关，表明拟杆菌属和Breznakia可能在葡萄糖代谢中具有协同作用。Erysipelatoclostridium和Breznakia与α-淀粉酶和纤维素酶活性呈显著正相关，可能是蜥蜴食性差异的反映。Odoribacter、Bilophila、Desulfovibrio和Methanomassiliicoccus与脂肪酶和胰蛋白酶活性呈正相关。这些细菌可能在具有高脂饮食的宿主中表现出协同效应。甲烷球菌属利用甲基胺和甲醇相关化合物，这些是蛋白质的中间产物，这可能解释胰蛋白酶活性与食虫蜥蜴较高蛋白质摄入量之间的正相关。肠道微生物的种类组成对饮食变化作出响应，而肠道微生物的代谢产出受膳食成分供应和饮食介导的微生物组成变化的影响。肠道中消化酶对底物的分解也影响代谢物的产生。因此，肠道功能对饮食的适应性响应似乎是肠道微生物、代谢物和消化酶之间相互作用的结果。

结论

总之，我们的结果表明，宿主物种和食性生态位可能塑造沙漠蜥蜴肠道微生物群的组成和功能。两种杂食性蜥蜴消化道拥有更多杯状细胞，表现出更高的淀粉酶和纤维素酶活性，其肠道微生物功能偏向碳水化合物代谢。食虫性蜥蜴显示更高的脂肪酶活性，并富含与高脂饮食相关的肠道微生物群。同域蜥蜴间的饮食重叠或分化促进了肠道微生物组成的不同适应策略。