雌性异型配子甲基化组中性别染色体依赖性衰老：W染色体DNA甲基化动态揭示鸟类性别特异性衰老机制

本综述首次系统揭示鸟类雌性特异性W染色体上DNA甲基化（DNAm）随年龄的动态变化，通过纵向全基因组甲基化测序（WGBS）技术，在斑胸草雀和寒鸦中发现年龄相关CpG位点（AR-CpG）显著富集于W染色体，且以去甲基化（hypomethylation）为主。该研究为表观遗传时钟（epigenetic clocks）研究提供了性别染色体分析新范式，揭示了性别特异性衰老的分子基础，对理解衰老相关基因调控和跨物种保守机制具有里程碑意义。

　　

1 引言

衰老的生物学功能随时间衰退的根本原因仍是未解之谜。作为生物年龄代理指标的分子标志物中，基于年龄依赖性表观遗传标记的指数在预测 chronological age（时序年龄）和 biological age（生物学年龄）方面展现出无与伦比的能力。这类指数主要基于CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点）上DNA甲基化（DNAm）的年龄相关变化。表观遗传时钟（epigenetic clocks）通过特定CpG位点的甲基化程度来推算时序年龄，为理解年龄相关表型提供了新视角。近年来，人类、模式与非模式动物乃至植物中均开发出多种表观遗传时钟。DNAm参与基因表达调控，是最稳定的表观遗传修饰之一，但在基因组中仍有一小部分CpG位点会发生年龄相关变化。跨物种研究DNAm随年龄变化的模式有助于识别不同类群间保守的衰老相关位点与过程。

性别在年龄相关病理和寿命中的差异在动物界普遍存在，雌性异型配子物种中同型配子性别平均寿命长7.1%，表明性别染色体与衰老存在关联。尽管性别与年龄密切相关，多数表观遗传衰老研究仍忽视性别染色体。本研究采用新颖、稳健的分析流程，从两种鸟类——斑胸草雀（Taeniopygia castanotis）和寒鸦（Corvus monedula）的血液样本中识别出年龄相关CpG（AR-CpG）位点，并首次纳入鸟类性别染色体（Z染色体和雌性特异性单倍体W染色体），评估AR-CpG位点在染色体上的分布是否偏离零期望。

2 材料与方法

2.1 样本来源

斑胸草雀血液样本来自长期实验，鸟类饲养于室外禽舍，采集10只已知年龄个体（6雄4雌）的20个纵向样本，平均采样间隔1470天。寒鸦样本来自荷兰格罗宁根南部野生种群，采集11只已知年龄成体（5雄6雌）的22个纵向样本，平均采样间隔2429天。所有样本均自出生起跟踪，精确年龄已知。

2.2 全基因组亚硫酸氢盐测序

使用innuPREP DNA Mini Kit从3μL有核红细胞提取总细胞DNA。全基因组测序由加拿大病童医院完成，采用Illumina HiSeqX或NovaSeq测序仪进行150bp双端测序。文库制备使用Swift Biosciences Accel NGS Methyl Seq试剂盒，DNA经Zymo Research EZ-96 DNA Methylation-Gold试剂盒进行亚硫酸氢盐转化。

2.3 生物信息处理

使用Trim Galore! v0.6.10修剪序列，FastQC和MultiQC进行质控。因文库制备试剂盒导致前10bp存在序列组成偏倚和M-bias，进一步修剪每条序列的前10bp。使用Bismark v0.14.433和Bowtie 2 v2.4.5进行比对。斑胸草雀数据比对至其参考基因组（GCA_003957565.4），平均比对效率64.5%。寒鸦参考基因组无W染色体组装，故比对至夏威夷乌鸦基因组（GCA_020740725.1），平均比对效率64.7%。

2.4 AR-CpG位点功能注释

使用UCSC工具gtfToGenePred和genePredToBed将GFF注释文件转换为BED12格式。使用R包genomation 1.4.1的annotateWithGeneParts工具对AR-CpG位点进行分层注释（启动子>外显子>内含子>基因间区），并通过自定义R脚本整合注释结果。

2.5 基因本体富集分析

使用Cytoscape v3.10.2的ClueGo插件v2.5.10进行GO富集分析，设置最少关联基因数为3，采用双侧富集-缺失检验和Benjamini-Hochberg多重检验校正，校正后p值≤0.05视为显著富集。

2.6 统计评估

使用R包janitor v2.2.0进行χ²检验比较各物种AR-CpG位点观察值与期望值，使用stats v4.1.2进行精确二项检验比较各染色体观察值与期望值（期望值=染色体CpG位点数×全基因组AR-CpG位点频率）。应用Benjamini-Hochberg校正控制错误发现率。使用χ²检验评估注释类别中AR-CpG位点分布，并通过精确二项检验进行事后检验。基于基因组覆盖度进行富集分析，计算各区域类型每染色体总长度（bp），比较观察值与基于相对基因组覆盖度的期望值，使用Fisher精确检验计算比值比（OR>1为富集，<1为缺失）。

3 结果

开发了识别AR-CpG位点的分析流程（图1a），包括四个步骤：

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  步骤1：设置最低平均覆盖度（斑胸草雀≥20×，寒鸦≥25×），根据初始覆盖度分布中位数（斑胸草雀6×，寒鸦7×）确定阈值。
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  步骤2：选择所有样本平均DNAm在40%-60%之间的CpG位点，这些位点随时间变化绝对值可能更大。
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  步骤3：选择多数样本共有的位点以增加检测概率（常染色体≥15样本，W染色体斑胸草雀≥6样本、寒鸦≥8样本）。
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  步骤4：计算每个CpG位点DNAm与Δage（个体采样时年龄与两次采样平均年龄之差）的Pearson相关系数，并按覆盖度每20单位选择相关值最高的前5%位点。

线粒体DNA未检测到AR-CpG位点，故排除后续分析。该流程适用于不同物种、不同质量DNAm数据及少量纵向样本，稳健性经不同 cutoff 参数验证（图S2、S3）。

斑胸草雀0.008%CpG位点（1,468/18,906,252）、寒鸦0.006%（1,218/21,835,349）显示年龄相关DNAm变化（图1）。AR-CpG位点存在于多数核染色体（图2），但线粒体未检测到。

多数AR-CpG位点位于W染色体，频率显著高于期望（斑胸草雀：图3A，占全部AR-CpG位点17%，p<0.0001；寒鸦：图3B，15%，p<0.0001）。Z染色体AR-CpG位点密度在斑胸草雀升高（占12%；χ²=2,622, df=36, p<0.001，图3），在寒鸦降低（3%；χ²=2,243, df=35, p<0.001，图3）。常染色体AR-CpG位点密度也存在变异：斑胸草雀6条染色体过表征、22条欠表征（表S2）；寒鸦6条过表征、10条欠表征（表S3）。斑胸草雀常染色体43%AR-CpG位点（n=632）DNAm随年龄增加（图2C），寒鸦仅24.5%（n=298）增加（图2D）。

AR-CpG位点主要位于基因间区，其次为内含子、启动子和外显子（斑胸草雀：图4A、D；寒鸦：图4A、D）。观察分布显著偏离零期望（斑胸草雀：χ²=5,655, df=3, p<0.001；寒鸦：χ²=7.98, df=3, p=0.04）。斑胸草雀各注释类别均显著偏离（表S4A），寒鸦仅启动子区AR-CpG位点显著多于期望（表S4B）。寒鸦W染色体外显子无AR-CpG位点，斑胸草雀有3个（图4B、F和图S1）。

富集分析显示两物种AR-CpG位点在注释类别和染色体类型间均显著富集（图5，表S5）。斑胸草雀所有染色体类型启动子区富集、内含子区缺失（图5A，表S5A）；寒鸦所有染色体类型内含子区缺失（图5B，表S5B）。两物种W染色体变异最强，基因间区富集且比值比最高（图5，表S5）。

启动子区DNAm已知可阻断基因表达，驱动发育、衰老和疾病表型变异。斑胸草雀性别染色体启动子区12个位点DNAm随年龄增加、21个减少（图4D）；寒鸦性别染色体启动子区所有AR-CpG位点（n=4）DNAm增加（图4H）。斑胸草雀常染色体启动子区80个AR-CpG位点（44增加、36减少）；寒鸦43个（15增加、28减少）（图4D、H）。少数启动子区AR-CpG位点可鉴定到特定基因（表S6）。两物种W染色体基因间区多数AR-CpG位点DNAm随年龄减少（图S1）。各物种各染色体类型各注释类别DNAm变化方向细节见图S1。

启动子含AR-CpG位点的基因的GO富集分析未发现两物种共享生物学过程或分子功能。

降低筛选严格性增加AR-CpG位点数量（图S2、S3），但染色体分布总体趋势不变，表明结果对流程参数选择稳健。

4 讨论

两物种W染色体高密度AR-CpG位点凸显了性别染色体DNAm驱动性别特异性衰老的潜力。研究优势在于纵向数据和全基因组甲基化数据提供了高分辨率全甲基组视图，得以检测先前未识别的性别染色体特异性DNAm模式。推测该模式可能贡献于性别依赖性衰老。寒鸦与斑胸草雀发现相似（AR-CpG位点总数、DNAm增减随时间变化、W染色体注释类别分布），表明发现可能普遍适用于雀形目鸟类。

DNAm随年龄增加（超甲基化）或减少（低甲基化）通常因CpG位点而异。两物种W染色体多数AR-CpG位点DNAm随年龄减少。鸟类W染色体转座子密度高，其表达有负 fitness 后果，可能解释W染色体DNAm显著高于常染色体。随年龄DNAm减少可能导致转座子表达抑制下降，进而基因组不稳定和基因表达失调，两者均驱动衰老。两物种W染色体AR-CpG位点显著富集于基因间区。除转座子外，基因间区还 harbors 调控长寿和衰老过程的 microRNA，并在细胞增殖、细胞死亡和造血中起重要作用。microRNA基因表达失调可导致恶性肿瘤和免疫细胞稳态破坏。W染色体基因间区DNAm随年龄减少表明抑制有害遗传元件（如致基因组不稳定 deleterious mutations）能力丧失，此为衰老标志之一。发现表明W染色体年龄相关DNAm变化可能与雌鸟寿命短于雄鸟相关。但需进一步纵向研究厘清此背景下发育与衰老相关表观遗传动态。

斑胸草雀Z染色体AR-CpG位点密度高于期望，寒鸦略低于期望。该差异匹配两物种寿命性别差异：斑胸草雀雌性寿命较短，寒鸦无性别差异。多数常染色体AR-CpG位点密度显著偏离零期望，但多数偏差较小，例外为斑胸草雀32和35号染色体密度高于期望。染色体间（除W染色体外）AR-CpG密度变异是否反映转座子频率或其他功能组分有待研究。

W染色体AR-CpG位点多数DNAm随年龄减少且位于基因间区，与人类单倍体异型配子Y染色体研究相反（后者多数AR-CpG位点随年龄超甲基化且位于基因内）。早期研究则发现哺乳动物X染色体AR-CpG位点相对较少，与寒鸦Z染色体一致。鸟类ZW性别染色体与哺乳动物XY不同源，故DNAm模式不同于雄性异型配子物种并不意外。表明性别染色体DNAm在雄性和雌性异型配子系统中可能扮演不同角色。结果强调驱动性别特异性衰老差异的关键机制可能在近缘种间保守但跨类群不保守。应致力在更广物种范围 decipher 性别染色体在衰老中的作用及不同性别决定系统物种 underlying 机制。

5 结论

利用两种鸟类纵向全基因组DNAm数据，表征了DNAm随年龄显著变化的CpG位点分布。位置、DNAm变化方向和功能意义表明鸟类性别染色体——尤其是单倍体雌性特异性W染色体——受 distinct 年龄相关表观遗传调控。且 observed 显著DNAm变化可导致基因组不稳定，潜在贡献于雌鸟寿命短于雄鸟。这些发现是 decipher 性别染色体表观遗传变化在衰老中作用的第一步，跨类群进一步研究对揭示衰老过程及性别依赖性衰老保守机制至关重要。