miR398-Dirigent模块通过影响细胞壁木质化和厚度负调控木薯对木薯普通花叶病毒的抗性

本研究首次揭示了木薯中miR398通过靶向Dirigent（Dir）基因负调控抗病毒防御的新机制。病毒感染诱导miR398表达上调，导致Dir基因下调，进而影响细胞壁木质化进程和厚度，最终削弱木薯对Cassava Common Mosaic Virus（CsCMV）的抵抗力。该发现为植物-病毒互作提供了新的分子见解，并为培育抗病毒木薯品种提供了潜在靶点。

　　

1 引言

木薯（Manihot esculenta）是热带和亚热带地区的重要粮食作物，但其生产受到病毒病的严重威胁。木薯普通花叶病毒（CsCMV）是影响木薯生产的主要病毒之一，在亚洲和美洲地区广泛分布，可导致30%–60%的产量损失。CsCMV属于甲型线形病毒科（Alphaflexiviridae）的Potexvirus属，具有正链单链RNA基因组，长度5.5–9 kb，编码5个开放阅读框（ORFs）。

microRNA（miRNA）是一类长度为21–24核苷酸的非编码小RNA分子，在植物生长发育和胁迫响应中起关键调控作用。植物miRNA对病毒感染既可发挥正调控也可发挥负调控作用。miR398是植物中保守的miRNA，最初在拟南芥中发现，响应非生物和生物胁迫包括病毒感染。研究表明，多种病毒感染的植物中存在miR398的积累，但其在病毒背景下的具体功能尚不明确。

木质素是复杂的异质聚合物，由愈创木基（G）、紫丁香基（S）和对羟基苯基（H）单体组成。木质素相关化合物木酚素在植物防御中起关键作用，其立体选择性生物合成由Dirigent（Dir）蛋白引导。Dir蛋白广泛存在于植物物种中，与抗病性相关。新证据表明Dir蛋白也参与木质化过程，如植物根中凯氏带木质素基扩散屏障的形成。

2 结果

2.1 病毒筛查显示病毒contig主要与CsCMV相关

通过高通量测序对海南儋州样品进行病毒病检测，结果显示大多数病毒contig与CsCMV分离株相关，包括先前鉴定的CsCMV分离株海南-DZ。因此，本研究选择CsCMV作为研究对象。

2.2 Mes-miR398是CsCMV感染下的潜在调控因子

小RNA测序分析发现，miR398在儋州（DZH）样品中显著上调，而在无CsCMV的对照样品（CK）中下调。表达量分析证实miR398在DZH样品中的差异和高表达，表明其在病毒复制或木薯对CsCMV感染的抗性中具有潜在重要性。

2.3 Mes-miR398响应CsCMV感染调控Dir基因

靶基因分析显示，Mes-miR398以最低置信度4.0靶向Manes.05G165700.1（Dir样蛋白）。RT-qPCR分析证实，在CsCMV感染的SC9样品中，Mes-miR398表达显著上调，而Dir基因表达显著下调。双荧光素酶报告实验证实Dir基因是Mes-miR398的直接靶标。

2.4 Mes-miR398过表达（OE398）增加CsCMV病毒载量并促进木薯茎部生长

构建OE398转基因木薯系，发现OE398系在CsCMV感染条件下表现出成熟的Mes-miR398表达显著上调。病毒载量量化显示，OE398-CsCMV样品中CP基因表达增加，表明Mes-miR398过表达植物中CsCMV病毒载量增强。有趣的是，OE398系表现出比空载体对照（NC2）增强的生长，表明Mes-miR398在生长调控中的额外作用。

2.5 Dir蛋白（A0A2C9VWW3）包含DIR家族保守基序并聚类在Dir-a亚家族

多序列比对证实Dir（A0A2C9VWW3）包含DIR家族特征性基序。系统进化树分析将Dir（A0A2C9VWW3）蛋白与Dir-a亚家族成员聚类在一起，Dir-a又分为两个 distinct组：Dir-a1和Dir-a2。

2.6 Dir基因的高效沉默增加CsCMV感染

利用病毒诱导基因沉默（VIGS）方法沉默Dir基因，发现沉默木薯植物感染CsCMV后，CP基因在OE398-CsCMV系中过表达，表明沉默Dir基因增加CsCMV感染。

2.7 Dir基因过表达（OEDir）减少CsCMV感染

Dir基因过表达结果显示，OEDir系中CP基因显著下调，表明CsCMV病毒载量减少。这与Dir基因沉默系中CsCMV感染增加的结果形成对比，强化了Dir基因减少CsCMV积累的结论。

2.8 CsCMV改变细胞壁膜：在ViDir系中观察到类似表型

透射电子显微镜（TEM）分析显示，CsCMV感染和Dir基因沉默系中细胞壁厚度显著减少。这些观察表明CsCMV感染改变细胞壁生物合成，Dir基因可能参与调控这一过程。

2.9 Dir基因（Manes.05G165700）参与细胞壁木质化

木质素含量量化显示，沉默系中木质素积累显著减少。Safranin O–Fast Green和Toluidine Blue O染色进一步支持了木质化减少的结果。亚细胞定位分析表明Dir蛋白主要定位在质膜上。这些结果证明Dir基因在木质素积累中起重要作用。

3 讨论

大流行和气候变化加剧了病毒病的影响，快速进化的RNA病毒使长期控制策略复杂化。化学处理在农业中仍然无效，卫生措施往往带来环境风险。因此，开发抗病毒品种是最可持续的方法。

本研究发现Mes-miR398作为木薯响应CsCMV感染的关键调控因子，通过靶向Dir基因。miR398-Dir模块通过影响细胞壁木质化和厚度负调控木薯对CsCMV的抗性。多种病毒感染的植物中发现miR398积累，但其在病毒背景下的具体功能先前不明确。

虽然miR398在胁迫响应调控中的作用已得到充分研究，但其在植物生长和发育中的功能仍知之甚少。本研究中miR398过表达促进茎部生长，表明其作为开发高产抗病作物的分子工具的潜力。

Dir蛋白已被证明在木酚素和木质素生产过程中介导双分子耦合的区域和立体选择性。木质化通常与对感染的结构防御相关，通过阻断微生物产生的纤维素酶、葡萄糖酶、漆酶和聚半乳糖醛酸酶的活性，在防止病原体攻击中起至关重要的作用。

在木薯中CsCMV感染后，Mes-miR398靶向并减少Dir基因调控，影响细胞壁膜木质化，从而促进CsCMV感染。过表达Dir基因增加细胞壁木质化并诱导木薯对CsCMV的抗性。

4 实验方法

4.1 植物和病原体材料及生长条件

使用木薯品种华南9号（SC9；对CsCMV敏感）和UG4（对CsCMV抗性）。CsCMV分离株海南-CM（CsCMV-CM）用于本研究。

4.2 取样和核酸纯化

显示疾病症状的叶片随机采集。使用TRIzol Universal RNA Reagent或RNAprep Pure Plant Plus Kit提取高质量总RNA。使用CTAB提取缓冲液提取DNA。

4.3 小RNA文库制备和测序

使用NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina制备小RNA文库。在Novaseq 6000平台上进行测序。

4.4 数据分析、病毒筛查和miRNA靶标预测

使用Bowtie程序将clean reads映射到参考基因组。使用miRBase数据库预测潜在miRNA候选。使用TargetFinder预测miRNA靶标。

4.5 RT-qPCR分析

使用HiScript IV RT SuperMix合成cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq II进行qPCR。使用TransScript Green miRNA Two-Step RT-qPCR SuperMix进行miRNA分析。

4.6 致病性测定

使用Premix Ex Taq（Probe qPCR）Bulk量化病毒载量。使用2^?ΔΔCt方法计算相对基因表达。

4.7 CsCMV农杆菌侵染性克隆的产生

将CsCMV-CM扩增并连接到pGreenII-35S载体的骨架片段中。

4.8 miR398和Dir过表达质粒的产生

设计引物从gDNA扩增前体miR398，从cDNA扩增Dir基因。将纯化的扩增产物连接到pCsCMV2-NC载体。

4.9 通过VIGS方法产生pCsCMV-Dir质粒

使用SGN VIGS Tool设计沉默靶基因。将纯化的扩增产物连接到pCsCMV-NC载体。

4.10 农杆菌浸润

将质粒转化到农杆菌GV3101（pSoup19）细胞中。调整接种物最终OD₆₀₀为0.8、0.8、0.5和0.5。

4.11 双荧光素酶报告实验

将Dir的3'UTR序列克隆到pGreenII0800-35S-LUC载体中，并与插入pGreenII-62SK-319a载体的Mes-miR398共转化。

4.12 亚细胞定位

将木薯Dir基因克隆到pCSXN-eGFP载体中。使用共聚焦成像读板仪检测荧光信号。

4.13 组织学分析和显微镜观察

将茎固定在FAA溶液中。使用自动显微切片机获得组织切片。使用Toluidine Blue O和Safranin O–Fast Green染色。使用TEM观察细胞壁结构。

4.14 木质素含量

使用Klason方法测定木质素含量。

4.15 生物信息学分析

使用AlphaFold3数据库预测蛋白质相互作用结构。使用Clustal Omega进行多序列比对。使用iTOL构建系统进化树。

4.16 统计分析

使用Student t检验与Bonferroni校正进行多重比较进行统计分析。