基于脂质纳米粒分离荧光-淬灭剂对的实时消毒监测技术研究

本文介绍了一种创新的实时表面消毒监测方法，通过脂质纳米粒（LNP）空间分离荧光标记DNA与淬灭剂标记互补DNA对，利用荧光共振能量转移（FRET）原理，实现了对消毒过程中化学分解作用与物理稀释作用的定性区分。该技术采用手持激光器、滤光片和智能手机相机组成简易检测系统，可直观监测医疗器械（如手术刀）的消毒效果，为医疗环境消毒验证与人员培训提供了快速、直观的新工具。

　　

摘要

清洁消毒的表面和医疗器械对维持卫生环境至关重要，尤其在医疗场所。当前消毒验证方法存在评估时间长或无法区分物理稀释与化学分解作用的局限。本研究建立了一种利用荧光标记DNA和脂质纳米粒（LNP）封装DNA的实时表面消毒监测方法。研究表明，乙醇类消毒剂可破坏LNP对淬灭剂修饰DNA与荧光标记互补DNA的空间分离，导致LNP解体，进而通过FRET淬灭荧光。该变化可通过手持激光器、滤光片和智能手机相机组成的简易系统即时检测。以手术刀为例，实验验证了该技术可定性区分消毒过程中的稀释与分解作用，为表面消毒的实时定性监测提供了新策略。

1 引言

表面消毒是维持卫生条件的关键环节，尤其在于医疗环境。消毒通过稀释（物理去除微生物）和分解（化学破坏微生物结构）共同作用降低表面微生物负载。现有快速检测方法如ATP测试和荧光染料法无法区分这两种作用，而琼脂接触平板法虽能准确反映微生物负载，但耗时长且需专业设备。本研究旨在开发一种结合LNP与荧光检测系统的快速光学方法，实现对消毒效果的实时定性监测，并区分稀释与分解作用。

2 结果与讨论

2.1 检测原理设计

系统设计基于LNP空间分离Cy3标记DNA与BHQ-2淬灭剂标记互补DNA。未消毒时，LNP膜隔离荧光团与淬灭剂，Cy3发出荧光；接触乙醇消毒剂后，LNP膜溶解，DNA互补配对使荧光团与淬灭剂靠近，通过FRET淬灭荧光。DNA序列经比对验证无环境交叉反应，确保特异性。

2.2 DNA配对与淬灭效率

实验表明，仅当Cy3-DNA与互补淬灭剂-DNA以1:1比例混合时发生有效淬灭，非互补序列无此现象。低比例下荧光增强可能与Cy3聚集体解离有关。

2.3 LNP封装与消毒响应

成功制备封装淬灭剂-DNA的LNP（粒径390±3 nm，DNA负载2.8 wt.%）。添加70v%乙醇后，LNP解体，样品浊度消失，荧光强度降至背景水平，表明消毒剂破坏LNP膜结构，释放淬灭剂-DNA与Cy3-DNA结合淬灭荧光。反向实验（封装Cy3-DNA）显示类似趋势但区分度较低，故优选淬灭剂内封方案。

2.4 表面检测系统优化

为适应表面检测，添加蔗糖-甘油合成基质稳定LNP，并搭建手持激光器（520 nm）-滤光片-智能手机相机检测系统。在钢表面沉积混合液后，添加乙醇可肉眼观察荧光淬灭，且信号稳定性长达2天。

2.5 稀释与分解的区分

引入DAPI作为被动对照染料（λ_ex=365 nm，不干扰Cy3检测）。擦拭实验显示，水擦拭后DAPI与Cy3荧光均因稀释减弱，但乙醇擦拭后仅Cy3荧光淬灭，证明消毒剂引发LNP分解而非单纯稀释。与传统荧光素法对比，后者无法区分消毒作用。

2.6 检测限与实用性

稀释实验确定Cy3检测限为0.001 μg·cm^?2，DAPI为0.01 μg·cm^?2。手动检测系统与酶标仪结果相当，但成本更低、灵活性更高。以手术刀柄凹槽为例，实验证明该技术可有效监测复杂几何区域的消毒，乙醇擦拭后Cy3荧光特异性淬灭。

2.7 技术比较与局限

与琼脂平板、ATP测试、LNP-PCR等方法相比，本技术具实时、定性、简易优势，但灵敏度较低（尤其对比qPCR的1 ng·L^?1检测限），且仅适用于乙醇等膜溶解型消毒剂。未来可通过优化DNA负载或基质配方提升性能。

3 结论

本研究证实LNP分离的荧光-淬灭剂对可用于表面消毒的实时定性监测，通过简易光学系统区分稀释与分解作用。该技术在医疗器械消毒验证与培训中具应用潜力，尤其适用于几何复杂区域。

4 实验部分

4.1 材料

使用定制DNA序列（Cy3_5‘与互补淬灭剂修饰序列），DAPI为被动染料，LNP脂质成分为DSPC、胆固醇、C14-PEG1000与SM-102（摩尔比10:38.5:1.5:50）。

4.2 LNP制备

通过乙醇相与水性相（含DNA）混合法制备LNP，37°C孵育1小时，表征粒径与电位。

4.3 检测方法

荧光检测使用酶标仪（λ_ex=520 nm）或手动系统，智能手机拍照后经图像处理去除绿偏。

4.4 实验设计

包括DNA淬灭测试、LNP解体验证、表面擦拭实验及医疗器械应用模拟。