利用切向流过滤（TFF）与阴离子交换膜层析（AEX）优化慢病毒载体中间纯化的下游工艺策略研究及其对产能与纯度的提升作用

本文系统评估了慢病毒载体（LVs）中间纯化过程中两种关键下游工艺策略：单独使用阴离子交换层析（AEX）与结合切向流过滤（TFF）的集成工艺（TFF-AEX）。研究显示，采用Sartobind? Convec D弱阴离子交换膜和Hydrosart?再生纤维素TFF膜，可显著提高动态结合容量（DBC）、缩短工艺时间，并有效清除宿主细胞蛋白和残留DNA，为大规模基因治疗载体生产提供高效、可放大的纯化解决方案。

　　

1 引言

慢病毒载体（Lentiviral Vectors, LVs）因其可携带较大基因负载并实现长期表达，已成为体外和体内细胞修饰的关键工具，广泛应用于CAR-T细胞疗法和β-地中海贫血治疗（如Zynteglo^?）等FDA批准的治疗产品中。然而，高纯度、高产量LVs的大规模生产仍是当前制造业的主要挑战，推动了下游纯化策略的创新。

膜层析技术，特别是阴离子交换（AEX）层析，因其传质阻力低、反压小、易于放大，逐渐替代传统树脂，用于LVs的捕获步骤。Sartobind Convec D作为一种弱AEX膜，具有较低的配体密度、无氢凝胶接枝和优化的孔径分布，被专门设计用于LVs的高效捕获。尽管如此，AEX层析仍面临洗脱需高盐浓度、功能载体回收率偏低（通常仅30%–40%）以及残留DNA共洗脱等问题。

切向流过滤（Tangential Flow Filtration, TFF）在LVs纯化中常用于前后处理步骤，主要实现产物浓缩、缓冲液置换和小分子杂质去除。采用Hydrosart等高亲水性再生纤维素膜，具备高流速、低蛋白结合和良好的稳定性，非常适用于病毒载体纯化。本研究系统比较了“仅AEX”与“TFF-AEX”两种中间纯化工艺在回收率、通量和杂质清除等方面的表现。

2 材料与方法

2.1 LVs的生产与澄清

通过聚乙烯亚胺（PEIpro）介导的HEK293细胞瞬时转染，在10 L生物反应器中生产VSV-G假型慢病毒。收获后采用20 μm、0.65 μm和0.8 μm Sartopure及Sartoclean过滤器进行澄清，病毒滴度为1.1×10⁸ TU/mL，分装贮存于-80°C，作为后续纯化实验的原料。

2.2 AEX层析捕获

使用Sartobind Convec D Nano膜（3 mL体积）在?KTA avant 150系统上进行层析实验。运行过程中实时监测电导率、UV 280 nm吸收和多角度光散射（MALS）信号，以分析病毒颗粒含量。层析流速设为5 MV/min，平衡缓冲液为20 mM Tris pH 7.0，洗脱缓冲液则在线性梯度或阶跃梯度模式下使用含1–2 M NaCl的Tris缓冲液。感染性回收率通过比较洗脱液与上样样品的病毒量计算，动态结合容量（DBC）通过MALS信号在10%穿透（DBC₁₀）时评估。

2.3 切向流过滤（TFF）

采用Sartocon Hydrosart Slice 200 TFF cassette（300 kDa，有效面积180 cm2）在Sartoflow Smart系统上进行超滤/透析过滤（UF|DF）。过程采用恒压进样模式，通过跨膜压（TMP）和压差（ΔP）优化渗透通量。从0.5 L起始体积进行10倍浓缩，随后用5体积交换缓冲液（50 mM HEPES, 20 mM MgCl₂, 5%蔗糖, pH 7.5）进行透析过滤，系统最后用滞留体积缓冲液冲洗并合并终产品。

2.4 分析方法

感染性滴度使用Incucyte S3活细胞成像系统通过GFP表达定量；病毒颗粒滴度通过p24 ELISA测定，假设1 ng p24对应1.25×10⁷病毒颗粒；总双链DNA（dsDNA）通过PicoGreen荧光法检测；总蛋白浓度则通过Bradford法测定。

3 结果

3.1 仅AEX工作流程

Sartobind Convec D膜在结合-洗脱模式下可有效捕获LVs，并清除85%–90%的宿主蛋白，但DNA清除率仅30%–60%。动态结合容量（DBC₁₀）达1.5×10¹¹颗粒/mL膜。线性梯度洗脱和阶跃洗脱均可在较低盐浓度（≤1 M NaCl）下实现病毒回收，感染性回收率在65%–74%之间。洗脱曲线中出现“双峰”，可能反映了病毒颗粒表面电荷异质性或不同结合种群的存在。

3.2 TFF-AEX工作流程

TFF步骤在优化TMP（0.55 bar）和ΔP（0.80 bar）下进行，实现了接近100%的感染性病毒回收，同时去除63%的蛋白质和45%的DNA。经TFF预浓缩和缓冲液置换后，AEX层析的DBC₁₀显著提高至6.2×10¹¹颗粒/mL膜，载量提高约4倍，层析加载时间从24分钟缩短至5分钟。最终AEX步骤感染性回收率约60%，蛋白质降至检测限以下，DNA清除率保持在49%。

3.3 仅AEX与TFF-AEX工作流程的综合对比

TFF-AEX工艺通过预浓缩和透析过滤显著降低样品体积和电导率，避免了AEX-only工艺中因稀释导致的处理体积增大问题。集成工艺使层析载量提高、处理时间缩短，同时杂质清除效果更优，DNA总清除率提升至81%，远高于仅AEX的30%–60%。残留DNA在最终产物中从104 ng/mL（AEX-only）降至27 ng/mL（TFF-AEX），更符合临床剂量中DNA残留低于10 ng/剂量的要求。

此外，高病毒浓度上样有助于减少不可逆结合，提高结合容量和工艺稳健性。尽管TFF可有效去除小片段DNA和蛋白质，但大片段DNA的清除仍需依赖DNase预处理等额外手段。

4 结论

本研究证实，将TFF整合到AEX层析前可显著优化LVs的中间纯化流程。TFF-AEX工艺不仅提高了动态结合容量和杂质清除效率，还大幅缩短了层析时间，降低了工艺体积，为大规模生产提供了经济、高效的解决方案。膜基AEX层析（如Sartobind Convec D）与高性能TFF（如Hydrosart）的组合使用，代表了基因治疗载体制造领域的重要技术进步。然而，要实现DNA的彻底清除，仍需结合核酸酶处理或其他正交纯化策略。