银纳米颗粒催化自聚合水凝胶：兼具抗感染与骨再生功能的可注射骨修复材料

本文报道了一种创新性可注射自聚合水凝胶骨填充材料（GelMA/ChiMA/HPA），通过银纳米颗粒（AgNPs）催化实现高效原位聚合，有效解决了传统骨水泥（PMMA）存在的渗漏、毒性和感染问题。该材料在感染颅骨模型中展现出卓越的抗菌性能（完全消除金黄色葡萄球菌）和骨再生能力（骨体积分数提升至49.9%），为微创手术治疗骨缺损提供了安全高效的新型生物材料解决方案。

　　

1 引言

骨缺损愈合在现代临床实践中仍面临重大挑战，特别是临界尺寸骨缺损缺乏自然愈合能力。传统聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥虽具有溶胶-凝胶行为允许注射应用，但存在渗漏、毒性、感染和不相容的多孔结构等问题。水凝胶基材料因其高亲水性、柔软接触性、与天然细胞外基质（ECM）相似性、高生物相容性以及可调节的物理化学特性而备受青睐。

本研究采用明胶甲基丙烯酰基（GelMA）和甲基丙烯酰化壳聚糖（ChiMA）构建水凝胶体系，其中GelMA具有高生物相容性，壳聚糖则是伤口愈合领域的明星材料。为最小化注射后骨填充剂的体内渗漏，需要精确控制粘度和聚合时间。银纳米颗粒（AgNPs）凭借其高电子活性可作为自由基聚合的催化剂，而聚多巴胺（PDA）既能作为封端剂又能作为还原剂与Ag⁺反应生成AgNPs。羟基磷灰石（HA）源自天然骨骼，其粗糙表面有助于捕获和固定AgNPs，进一步提高催化效率。

2 结果

2.1 合成

HPA催化剂通过简便的两步合成法制备：首先在羟基磷灰石（HA）上涂覆具有还原能力的聚多巴胺（PDA），随后HA-PDA混合物还原Ag⁺得到最终产物HA-PDA-Ag混合物（HPA）催化剂。直接在不加HA的0.2% PDA溶液中还原Ag⁺得到的AgNPs直径为103.5 ± 26.3 nm，而通过两步合成法还原的AgNPs直径显著减小至10.5 ± 2.0 nm，这种小尺寸纳米颗粒可产生更大的表面体积比，从而增强催化作用。

将制备的HPA粉末加入GelMA和ChiMA溶液中形成G-C-HPA水凝胶前体。在引发剂过硫酸铵（APS）存在下，G-C-HPA水凝胶可在2-10分钟内快速完成从溶胶到凝胶的转变。时间扫描显示水凝胶很早就开始聚合，储存模量上升并在约400秒时达到平台期，表明聚合完成。0.5% HPA组比0.1% HPA组表现出更高的弹性响应，且10% GelMA在没有ChiMA的情况下储存模量持续上升，900秒内未完成聚合，证明ChiMA在复合水凝胶前体中具有加速聚合和促进机械响应的积极作用。

获得的氢凝胶呈刚性、不透明、灰棕色，颜色来源于黑色AgNPs和棕色PDA。HPA浓度越高，聚合速度越快。单独ChiMA无法聚合，单独HA粉末或HA-PDA粉末也不能使水凝胶聚合，证明只有Ag具有催化能力。直接还原的较大AgNPs（103.5 nm）也能引发聚合，但速度显著慢于复合HPA颗粒，表明有效的催化成分是Ag元素。Ag通过其高电子共振和PDA的动态儿茶酚/醌系统催化自由基聚合：儿茶酚基团首先将Ag离子还原成AgNPs并转变为醌基，随后AgNPs因其高表面等离子体共振效应将醌基重新转化为儿茶酚基，这种动态可逆的自氧化还原系统有助于自由基生成，从而促进聚合。HA的加入通过增大表面体积比显著提高了PDA-Ag动态氧化还原系统的催化能力。

2.2 表征

通过FTIR检测明胶、GelMA、壳聚糖、ChiMA和制备的水凝胶的化学结构。GelMA和ChiMA的成功合成通过特征吸收峰得到证实，GelMA的MA接枝度为85%，ChiMA为43.3%。由GelMA和ChiMA组成的复合水凝胶在1638、1562和1238 cm^-1处显示出酰胺I、II和III带，1078和1106 cm^-1处的峰来自ChiMA，表明成功合成了同时含有GelMA和ChiMA的水凝胶。HPA水凝胶组在2974至3550 cm^-1处有宽表达，表明存在PDA的O-H振动，而TEMED组无此特征。

G-C-HPA水凝胶在SEM下显示出高度多孔形态和相互连接的孔隙，这种多孔形态结构对新生组织和细胞生长引导、营养传递和液体循环至关重要。HPA以纳米薄片形式良好分散并嵌入水凝胶基质的相互连接壁中。EDS图谱进一步证明了Ca、P和Ag元素的存在，表明Ag和HA的成功引入。

2.3 物理性质

在5至50°C的温度扫描中，G-C双网络水凝胶保持稳定，表明GelMA的自由基聚合成功。频率扫描中储存模量G'依赖于频率，表明水凝胶具有凝胶特性。0.5 HPA组比0.1 HPA组具有更高的G'值，表明HPA含量有助于水凝胶的弹性。5G0.5C-T、5G0.5C0.1HPA和5G0.5C0.5HPA的压缩屈服应力分别为132 kPa（61%应变）、10 kPa（35%应变）和26 kPa（46%应变）。0.5HPA表现出比0.1HPA更强的机械强度，压缩模量和压缩断裂应变与先前报道的双网络GelMA和ChiMA相似，处于典型可接受范围内。HA颗粒含量可增加机械强度，与文献研究一致。

5G0.5C0.5HPA、5G0.5C0.1HPA和5G0.5C-T的溶胀度相似，约为原始重量的7倍，表明溶胀比不受催化剂严重影响，而更依赖于水凝胶组成。单独GelMA溶胀度高约12倍。孔隙率测试显示0.5 HPA、0.1 HPA和TEMED组之间无显著差异，均在约60%总体积范围内波动。对于微创手术应用，植入物应具有与新组织再生相匹配的降解速率。G-C-HPA水凝胶在前7天保持非常稳定和逐渐的降解速率，单独GelMA组（5G-T）水凝胶重量下降较快，单独ChiMA组（0.5C-T）在7天后快速降解。

2.4 可注射性

平滑注射对于微创手术应用至关重要。0.1%和0.5% HPA均表现出良好的剪切稀化行为，允许前体通过注射器而没有太大阻力。有趣的是，0.5% HPA比0.1% HPA具有更低的粘度，推测是由于更高浓度的颗粒阻碍了前体中氢键的形成。正如预期，前体可通过最薄的注射器，扩展了微创注射治疗的应用范围。通常，聚合时间必须快以防止注射后前体扩散，但在临床实践中，也应允许一定的操作时间窗口。实验发现即使前体未完全聚合，只要聚合开始，前体仍会堵塞注射器。比较后发现，5G0.5C0.1HPA具有最适合临床操作的聚合时间。0.1% HPA前体在大鼠皮下注射后易于注射并能快速聚合而无任何扩散。

2.5 细胞活力

GelMA、ChiMA、PDA和HA都是组织工程中广泛认可的生物友好材料。然而，由于AgNPs的物理化学性质可能依赖于浓度和尺寸，需要仔细检查Ag元素的细胞毒性。通过L929细胞培养检查G-C-HPA水凝胶的细胞毒性。视觉上，染色图像显示活/死L929细胞，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。0.1% HPA浓度与细胞兼容，没有显著细胞死亡，活细胞强度与空白组相似。随着HPA浓度增加，活细胞数量下降，在0.5%时几乎无活细胞观察。CCK8评估也显示0.1% HPA具有与空白组匹配的细胞活力，0.25% HPA细胞活力水平较低，而0.5% HPA显示出明显细胞毒性。

该结果证明5G0.5C0.1HPA具有生物友好性，对细胞无害。0.5HPA组观察到的较高细胞毒性归因于Ag浓度增加，因此必须仔细控制Ag含量以平衡抗菌功效与细胞毒性风险。在1 mL 5G0.5C0.1HPA样品（相当于1 mg HPA粉末）中，AgNP含量约为353 μg。在聚合水凝胶中，AgNPs固定在HA表面并进一步封装在水凝胶网络内。与先前报道的骨水泥中银浓度相比，本研究中约0.035 wt.%的Ag被认为处于安全范围内。

2.6 抗菌性

Ag最重要的用途之一是其通过接触细菌细胞壁而闻名的杀菌能力。切片水凝胶样品的抑菌圈测试显示，5G0.5C0.1HPA样品能有效杀死大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。GelMA和ChiMA水凝胶不能杀死周围细菌。与空白对照组相比，5G0.5C0.1HPA样品消除了所有大肠杆菌，没有可见细菌残留。对金黄色葡萄球菌也表现出强抗菌活性，有效消除了大量细菌。相反，GelMA和ChiMA显示出最小抗菌效果，几乎没有细菌消除证据。

抗菌研究进一步证明，将Ag涂覆到HA上的方法不仅作为催化剂，而且在组织工程材料中对于消除细菌至关重要。即使只有0.1%的HPA也能具有如此强的抗菌效果，主要归因于Ag离子的持续释放。随着时间的推移，AgNPs逐渐氧化成Ag⁺离子并释放。在水中24小时后，0.1HPA组释放的Ag⁺离子浓度为126.90 ± 18.43 μg mL^-1，该浓度随时间显著下降，第3天为22.62 ± 4.63 μg mL^-1，第5天为4.38 ± 1.69 μg mL^-1，第7天为0.54 ± 0.28 μg mL^-1。这种持续的Ag离子释放证明了儿茶酚/醌动态氧化还原系统的有效性，不仅在催化初始释放方面，而且在整个应用期间维持连续的Ag⁺离子生成。

2.7 体内颅骨缺损愈合

在雌性大鼠颅骨上制造骨缺损以研究G-C-HPA可注射水凝胶的体内性能。为最大化水凝胶潜力，在缺损处应用金黄色葡萄球菌（SA）细菌以监测水凝胶在感染模型中的表现。通过电钻在大鼠颅骨上制造直径5 mm的缺损，感染后缺损处用预制的GelMA作为对比组。根据高生物相容性、出色抗菌活性和平滑注射性，选择5G0.5C0.1HPA浓度进行体内研究。将5G0.5C0.1HPA水凝胶前体注射到缺损中并进行自聚合，观察到水凝胶前体在所有大鼠上能在10分钟内聚合，随后缝合缺损伤口等待愈合。

伤口细菌感染对患者可能是致命的，尤其当发生在内部骨缺损时更难触及。在体内缺损制造3天后，通过从骨髓腔冲洗SA评估抗菌活性。视觉上，SA空白组和SA GelMA组有大量SA细菌生长，SA GelMA组细菌存活率为100.01 ± 3.83%，GelMA组为98.13 ± 1.72%，表明即使GelMA被认为是优秀的组织工程材料，它也没有体内抗菌能力。相反，阴性空白组没有视觉细菌，存活率仅0.08 ± 0.04%。5G0.5C0.1HPA样品组培养基中视觉细菌极少，存活率仅0.72 ± 0.17%。这种出色的抗菌能力是0.1% HPA组分的结果，该组分涂覆有AgNPs。如此低的0.1%浓度，HPA组分能有效抑制体内细菌，同时保持高生物相容性。

治疗1个月后拍摄照片，阴性空白组变化最小，愈合骨体积分数（BV/TV）为5.85 ± 0.95%。感染SA空白和SA GelMA组在缺损沿边缘都发展出粗糙边缘，表明人造缺损相邻的健康颅骨组织被感染和腐蚀。这两组的愈合性能比阴性空白组差，BV/TV分别为1.25 ± 0.44%（SA空白）和2.25 ± 0.57%（SA GelMA）。SA 5G0.5C0.1HPA组在所有组中具有最佳愈合过程。首先注意到缺损边缘保持光滑，表明缺损未受细菌感染影响。CT扫描中，骨组织也开始在缺损区域内生长，导致更高的BV/TV为12.56 ± 0.85%。

治疗2个月后，水凝胶和对比组之间的差异更加明显。阴性空白组留待自然愈合，无治疗或感染，2个月后其BV/TV最终达到16.21 ± 0.27%。SA空白和SA GelMA组克服了腐蚀，但在缺损圈仍留下一些明显标记。相比之下，我们的5G0.5C0.1HPA促进了颅骨组织愈合，BV/TV比率高达49.90 ± 1.44%，没有感染或腐蚀迹象。与自然愈合相比，证明G-C-HPA复合水凝胶能显著安全地加速骨愈合过程。

定量RT-PCR分析显示，该复合材料显著上调了关键成骨标志物的表达，包括COL1、RUNX2、OPN和OCN，超过了GeIMA和感染空白对照组。RUNX2和COL1的较高水平表明该材料有助于触发早期成骨细胞分化，而OPN和OCN的强表达表明在骨矿化和基质形成方面进展良好。即使在细菌条件下，这种可注射G-C-HPA水凝胶在支持骨形成和抵抗感染方面表现出强大性能，证明了其双重功能。

从H&E染色看，治疗1个月后，阴性空白组和G-C-HPA水凝胶组都有新骨组织形成的迹象。相反，SA空白组和SA GelMA组有许多炎症细胞。治疗2个月后，只有G-C-HPA组显示出大面积的成熟新骨组织，而其余组仍有不同水平的空腔。Masson染色结果支持这一结论。在Masson染色中，自然愈合组（阴性空白组）仅因缓慢弱骨形成而产生非常微弱的染色。相比之下，治疗第一个月后，G-C-HPA组开始显示成熟骨组织，表现为集中红色染色。治疗2个月后，G-C-HPA组有大面积分布良好的骨组织（蓝色）填充骨组织（红色）。Safrainin O-Fast Green是软骨软组织形成的指标，红色显示软骨软组织，蓝/绿色显示骨组织。观察到G-C-HPA组在治疗1个月时对形成骨组织而非软骨组织贡献更大。第二个月，软骨组织显著填充骨组织，形成成熟的再生骨。G-C-HPA组未观察到红色染色，显示无软骨软组织形成。总体而言，通过对体内颅骨缺损模型的病理研究，G-C-HPA组在体积、成熟度和消毒方面具有优异的愈合性能。随着成功的颅骨缺损愈合模型，这种可注射G-C-HPA水凝胶有望应用于其他骨缺损治疗。可注射性和高生物相容性允许在非侵入性手术操作中的许多应用。

3 材料与方法

研究采用Sigma-Aldrich、Sima-lab、Aladdin和DM Reagent等供应商提供的化学材料。通过一系列合成方法制备了ChiMA、GelMA和HPA粉末，其中ChiMA通过壳聚糖与甲基丙烯酸酐反应制备，GelMA通过明胶与甲基丙烯酸酐反应制备，HPA通过多巴胺在HA表面自聚合后还原Ag⁺制备。水凝胶通过将GelMA、ChiMA、HPA粉末和引发剂APS溶液混合制备。

4 结论

本研究报告了一种创新性骨填充凝胶，是一种高生物相容性水凝胶前体，能在体内10分钟内自聚合。该前体由GelMA、ChiMA、HA、PDA和AgNPs构成。HA、PDA和AgNPs被合成并作为抗菌剂和催化剂。HA具有粗糙表面，可增加AgNPs的表面体积比，显著加速无需外部刺激的自聚合。这种组合使前体具有低粘度，允许通过非常薄的注射器平滑注射，从而通过非侵入性手术程序到达内部器官。

经检测，该前体被证明在HPA浓度为0.1%时具有高细胞亲和力、低细胞毒性和优异抗菌活性。确定5G0.5C0.1HPA浓度后，将前体应用于体内感染颅骨动物模型。应用我们的G-C-HPA前体后，细菌被有效消除，没有对相邻骨组织造成进一步腐蚀。经过2个月的G-C-HPA治疗，颅骨缺损能再生约50%的原始体积。再生骨组织经检查比对比组更成熟。

因此，G-C-HPA可注射前体被证明是解决常见骨水泥失败的方案，在非侵入性骨手术治疗中具有巨大潜力。