基于单细胞多组学测序揭示灵芝孢子粉增强COVID-19疫苗加强针IFN-α介导的抗病毒能力

本研究针对疫苗效力随时间减弱的问题，探讨了灵芝孢子粉（GLSP）作为COVID-19疫苗佐剂的潜力。通过单细胞多组学技术，研究人员发现GLSP可显著提升中和抗体抑制率，增强经典单核细胞比例并促进其与T、B细胞的相互作用，同时强化IFN-α应答。关键活性成分灵芝酸H（GH）被鉴定为诱导IFN-α反应的核心物质。该研究为开发安全有效的口服疫苗佐剂提供了新策略，具有重要的临床应用价值。

　　

随着COVID-19全球大流行的持续，疫苗已成为控制疫情、降低死亡率的关键手段。然而，疫苗效力随时间推移而减弱的问题日益凸显，多种新冠疫苗在接种数月后保护效果下降显著，这给群体免疫的建立和维护带来了挑战。疫苗佐剂的开发是解决这一问题的有效策略，但现有佐剂如铝佐剂、MF59等存在安全性担忧或作用局限，因此迫切需要开发能系统激活免疫反应且安全稳定的新型佐剂。

传统中药活性成分因其免疫调节潜力而受到关注。灵芝（Ganoderma lucidum, GL）作为一种传统药用真菌，其提取物具有诱导细胞和体液免疫反应的卓越能力。灵芝孢子（Ganoderma lucidum spore powder, GLSP）作为活性成分的富集部位，在免疫调节方面展现出巨大潜力，但其在人类流行病学疫苗中的应用尚未深入探索。为此，研究人员开展了一项研究，评估GLSP作为COVID-19疫苗加强针佐剂的效果，并深入阐明其免疫调节机制。该研究发表在《Journal of Advanced Research》上。

为开展本研究，研究人员采用了多种关键技术方法。他们从浙江省疾病预防控制中心获取了195名志愿者的人外周血样本，这些志愿者年龄在20至60岁之间，此前至少接种过两剂COVID-19疫苗且无疫苗过敏或自身免疫性疾病史。志愿者被随机分为对照组和GLSP干预组，两组均接种了科兴控股生物技术有限公司生产的COVID-19疫苗（CoronaVac）加强针。GLSP干预组每天口服2克GLSP，持续六个月。研究运用了微量中和试验测定中和抗体（NAb）抑制百分比，通过超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）和超高效液相色谱多反应监测质谱（UPLC-MRM-MS）对GLSP进行化学成分表征，并采用单细胞多组学测序（包括scRNA-seq、scVDJ-seq和scATAC-seq）探究GLSP的作用机制。此外，还通过分子对接和体外验证实验识别了可诱导IFN-α产生和信号传导的三萜类化合物。

研究结果丰富而多层次，从多个方面揭示了GLSP的佐剂效应和机制。

在“GLSP increases antibody levels in individuals with moderate baseline immunity”部分，研究发现，与单独接种疫苗相比，GLSP显著增强了基线免疫力中等参与者在接种后90天的NAb抑制百分比。这表明GLSP对中等免疫力个体的免疫系统具有显著的佐剂效应。

在“GLSP amplifies the efficacy of vaccine booster effects on immune cell proportion”部分，通过单细胞转录组测序，研究人员发现疫苗接种影响了免疫细胞组成的比例，增加了B细胞和先天免疫细胞的比例，同时降低了T细胞的比例。而GLSP的干预进一步放大了这些变化。

“Increased proportion and anti-virus response of classical monocytes after GLSP intervention”部分揭示，GLSP显著扩大了骨髓细胞比例，特别是经典单核细胞（CMs），并增强了它们与T细胞和B细胞的相互作用。GLSP还促进了先天和适应性免疫细胞中更强的IFN-α反应。在先天免疫中，GLSP增强了与IFN-α刺激相关的转录因子活性和染色质可及性。

“GLSP modulates the activity of transcription factors and chromatin accessibility for genes involved in the IFN-α response”部分表明，GLSP通过影响上游调控，在疫苗接种背景下促进先天免疫力。SCENIC分析揭示了多个调节子（regulon）的差异活性，包括与IFN-α反应信号传导相关的STAT1、STAT2、IRF7和IRF9。scATAC-seq分析进一步证实，GLSP干预后，超过40%的IFN-α相关基因表现出增强的染色质可及性评分。

在“GLSP enhanced the production and response to IFN-α”部分，研究证实GLSP有效刺激了IFN-α的产生，并增强了细胞对该细胞因子的反应。接种后90天，GLSP干预组的血清IFN-α浓度显著高于单独加强注射组。

“GLSP enhanced interaction between myeloid cells and lymphocytes”部分通过细胞间相互作用分析发现，GLSP增强了骨髓细胞与淋巴细胞之间的相互作用强度，特别是经典单核细胞与CD8⁺ T细胞和 na?ve B细胞之间的通讯。

“Modifications in BCR repertoire by GLSP associated with enhanced antiviral resistance”部分显示，GLSP改变了BCR基因的使用和克隆优势，与更高的抗病毒抵抗力相关。GLSP干预导致IGHV3-72和IGHV4-59的使用偏向，这些基因的使用与更强的IFN反应和阳性MVS（Meta-viral signature）相关。

“Glsp-specific expanded TCR clones with stronger IFN-mediated antiviral response and enhanced affinity for virus”部分表明，GLSP改变了TCR基因的使用趋势，并特异性扩增了具有更强IFN介导的抗病毒反应和更高病毒亲和力的TCR克隆。MixTCRpred预测显示，GLSP干预维持了能够有效结合病毒 epitopes 的TCR比例。

“Identification and functional characterization of GLSP triterpenoids as activators of IFN-α signaling”部分通过分子对接和体外实验，鉴定出灵芝酸H（GH）是负责诱导IFN-α反应的关键活性成分。GH能显著促进IFN-α分泌并上调ISG15等干扰素刺激基因（ISG）的表达。

研究结论与讨论部分归纳指出，GLSP通过多模式机制增强了IFN-α介导的抗病毒防御能力。它系统性提升了血清IFN-α水平，在先天免疫层面重编程了骨髓细胞（特别是经典单核细胞）的比例和功能，增强了其转录因子活性和染色质可及性；在适应性免疫层面，它改变了BCR和TCR的克隆选择， favoring 具有更强IFN信号和抗病毒能力的受体库。关键活性成分灵芝酸H（GH）被鉴定为激活IFN-α通路的核心物质。这项研究不仅为GLSP作为新型疫苗佐剂的开发提供了坚实的科学依据，响应了利用现代技术挖掘传统中药临床价值的号召，也为解决现有疫苗效力衰减问题提供了安全有效的口服解决方案，具有重要的临床转化前景和应用价值。