Sp100A亚型通过SUMO互作基序介导组蛋白伴侣HIRA向PML核体定位的机制研究

本研究针对PML核体(PML-NBs)在染色质动态调控和抗病毒防御中的作用，探讨了Sp100不同亚型对组蛋白伴侣HIRA定位至PML-NBs的调控机制。研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建Sp100敲除角质形成细胞模型，结合结构预测与分子动力学模拟，发现Sp100A亚型通过其SUMO互作基序(SIM)特异性引导HIRA复合体定位，该过程不依赖干扰素即时信号传导但可能参与表观遗传记忆建立，为核体功能调控提供了新见解。

　　

在细胞核的复杂微观世界中，PML核体(PML nuclear bodies, PML-NBs)如同动态的功能枢纽，参与染色质结构调控、基因表达和抗病毒防御等多种关键生物学过程。这些亚核结构由PML蛋白组装而成，并招募大量组成性或瞬时结合蛋白，包括多种染色质相关调节因子。其中，组蛋白H3.3变异体的沉积由两个组蛋白伴侣复合体介导：Daxx/ATRX和HIRA/UBN1/CABIN1。值得注意的是，HIRA复合体仅在细胞衰老、干扰素(IFN)刺激或病毒感染时才被招募至PML-NBs，而这种招募的分子机制长期以来并不明确。

先前研究表明，Sp100蛋白作为PML-NBs的主要组成成分之一，可能在HIRA的定位过程中发挥关键作用。Sp100基因通过选择性剪接产生四种主要亚型(Sp100A、B、C和HMG)，这些亚型共享N端区域但具有不同的C端功能域，在转录调控中表现出激活或抑制的不同功能特性。然而，具体是哪种Sp100亚型负责介导HIRA的定位，以及通过何种分子机制实现这一过程，仍然是未解之谜。

为了解决这些问题，Ashley N. Della Fera等人在《Journal of Biological Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在永生化人角质形成细胞系NIKS中成功构建了Sp100敲除细胞系，通过免疫荧光、免疫印迹、RNA测序和结构预测等多种技术手段，系统研究了Sp100各亚型在HIRA定位中的作用机制。

研究采用的主要技术方法包括：利用CRISPR-Cas9技术构建Sp100完全敲除的NIKS角质形成细胞模型；通过免疫荧光显微术分析蛋白质亚细胞定位；使用Western blot检测蛋白质表达水平；采用RNA-seq进行转录组分析；运用AlphaFold 3、Chai-1、Boltz-2等AI方法进行蛋白质结构预测和分子动力学模拟。

生成Sp100缺陷型NIKS细胞系

研究人员设计了5个CRISPR Cas9引导RNA靶向Sp100基因的外显子3、6和8，通过电转染和流式分选获得Sp100敲除克隆。经免疫荧光和Western blot验证，成功获得了5个Sp100完全敲除的细胞系(Sp100 KO 1-5)和2个载体对照细胞系(Vector 1-2)。

Sp100缺失不影响角质形成细胞分化

与先前siRNA敲降研究结果不同，Sp100完全敲除的NIKS细胞在器官型培养中仍能形成正常分化的复层上皮，表明Sp100并非角质形成细胞分化所必需。

PML-NB形成和Daxx定位在Sp100 KO角质形成细胞中未改变

研究发现Sp100缺失并不影响PML-NBs的形成，也不影响Daxx蛋白向PML-NBs的定位。干扰素刺激后，PML和Daxx蛋白水平在敲除细胞和对照细胞中相似。

Sp100是HIRA定位到PML-NBs所必需的

在NIKS对照细胞中，干扰素处理显著促进了HIRA向PML-NBs的定位，而在Sp100敲除细胞中，无论是否干扰素处理，HIRA几乎从不与PML-NBs共定位。HIRA蛋白水平在Sp100存在或缺失情况下保持稳定，表明Sp100影响的是HIRA的定位而非表达。

Sp100是HIRA复合体成员定位到PML-NBs所必需的

研究进一步发现，HIRA复合体的其他成员(UBN1和ASF1a)同样依赖Sp100才能定位到PML-NBs。这些蛋白的水平不受干扰素处理或Sp100缺失的影响。

Sp100A亚型促进HIRA定位到PML-NBs

通过在Sp100敲除细胞中外源表达不同Sp100亚型，研究发现只有Sp100A能够有效引导HIRA定位到PML-NBs。尽管Sp100HMG也频繁定位于PML-NBs，但几乎不能招募HIRA；Sp100B和Sp100C即使定位于PML-NBs，也几乎不能引导HIRA定位。

Sp100A SUMO相互作用基序对HIRA在PML定位很重要

研究人员构建了系列Sp100A突变体，发现SUMО相互作用基序(SIM)的突变虽然不影响Sp100A自身的PML-NBs定位，但显著削弱了其引导HIRA定位的能力。有趣的是，干扰素处理能够部分恢复mSIM突变体的功能，表明干扰素可能通过增强全局SUMО化水平来补偿SIM功能的缺失。

Sp100异构体的结构预测和Sp100A突变的位置

通过AI辅助的结构预测和分子动力学模拟，研究人员发现Sp100各亚型均含有内在无序区域(IDRs)，这些区域可能通过液-液相分离(LLPS)机制参与PML-NBs的生物分子凝聚体形成。

RNA-seq分析显示Sp100 KO细胞中基础或干扰素诱导的基因表达没有显著变化

转录组分析表明，Sp100缺失并不影响干扰素刺激基因(ISGs)的即时诱导表达，这与HIRA向PML-NBs的定位不是干扰素即时信号传导所必需的观点一致。

研究结论表明，Sp100A亚型是引导组蛋白伴侣HIRA定位至PML核体的主要驱动因子，这一过程依赖于Sp100A的SUMO相互作用基序(SIM)。值得注意的是，HIRA向PML-NBs的招募虽然不参与干扰素的即时信号传导，但可能通过延迟的H3.3沉积在干扰素刺激基因上，参与维持表观遗传记忆。这一发现不仅揭示了Sp100不同亚型在染色质动力学中的功能多样性，也为理解组蛋白伴侣与PML核体之间的分子联系提供了重要见解。

该研究的创新之处在于首次在完全缺失内源Sp100的模型系统中明确了Sp100A亚型的特异性功能，并揭示了SIM基序在这一过程中的关键作用。研究人员提出的模型认为，干扰素刺激后PML-NBs可能作为核内"仓库"平衡HIRA和H3.3的核内可用性，或者HIRA在PML-NBs的定位是延迟的H3.3掺入所必需的，从而建立干扰素应答的表观遗传记忆。这些发现为未来研究核体在先天免疫记忆中的作用提供了新的实验体系和分子基础。