协同利用乙酸和丁酸能够提高高底物负荷下Clostridium kluyveri CICC 24509菌株产生的己酸产量

《Journal of Environmental Radioactivity》：Synergistic acetate-butyrate co-utilization enhances caproate production by Clostridium kluyveri CICC 24509 under high substrate loads

微生物链延伸技术通过协同电子受体提升高浓度乙醇废渣中Caproate生产效率，Clostridium kluyveri CICC 24509在20g/L乙醇下实现13.7g/L Caproate产量，与乙酸/丁酸双受体体系结合达16.0g/L，日产量4.0±0.1g/L。

　　

张宇彤|陈川|王雪婷|邢德峰|任楠琦|赵雷

中国哈尔滨工业大学环境学院，城市-农村水资源与环境国家重点实验室，污泥安全处置与资源化国家工程研究中心，哈尔滨，150000

摘要

微生物链延长是一种将低价值废物流转化为有价值化学品（如己酸）的循环经济策略。然而，实现其全部潜力受到一些挑战的阻碍，包括微生物对工业相关高底物浓度的耐受性有限以及电子供体-受体利用效率不高。本研究通过评估一种先前未被表征的链延长菌株Clostridium kluyveri CICC 24509在高底物条件下的表现来应对这些限制，其中乙醇被用作电子供体。我们系统地研究了乙醇浓度、总碳负荷（高达1370 mM C）和电子受体组成的影响。虽然单独使用乙酸就能支持稳定的生产（在20 g L^-1乙醇条件下产生13.7 g L^-1己酸），但观察到当同时使用乙酸和丁酸作为电子受体时具有显著的协同效应。这种双受体策略使纯C. kluyveri培养物产生的己酸浓度达到最高水平，为16.0 g L^-1，生产速率为4.0 ± 0.1 g L^-1 d^-1。与单一受体系统相比，这种方法显著提高了短链脂肪酸的转化效率。这些发现突显了Clostridium kluyveri CICC 24509的强大生物催化能力，并展示了一种将高有机负荷工业发酵残渣高效转化为己酸的有前景的策略，为可扩展的资源回收铺平了道路。

引言

将丰富的低价值有机废物流转化为高价值的生化产品是循环生物经济的核心（Chen等人，2017年）。微生物链延长（CE）作为一种非常有前景的策略，能够将短链脂肪酸（SCFAs）如乙酸和丁酸转化为有价值的中间链脂肪酸（MCFAs），尤其是己酸，这是一种多用途的C6平台化学品（Angenent等人，2016年）。虽然混合培养系统具有较高的稳定性，但纯培养物，特别是使用模型链延长菌Clostridium kluyveri（C. kluyveri），可以提供更好的控制并可能获得更高的产品产量（Shi等人，2022年）。然而，要将C. kluyveri驱动的CE转化为高效、工业规模的过程，需要克服在高负荷条件下底物利用的相关关键限制。

CE的效率在很大程度上取决于底物组成，特别是电子供体（EDs）和电子受体（EAs）之间的相互作用。乙醇在工业废液中（如葡萄酒厂废水和糖蜜废水）普遍存在，被广泛认为是一种有效的ED（Wang等人，2022年）。然而，关于其最佳浓度和潜在抑制作用仍存在争议。一些报告指出在200 mM以上浓度下会有抑制作用（Wu等人，2020年），而其他研究表明C. kluyveri的耐受性可超过300 mM（Yin等人，2017年）。关键的是，大多数现有研究都集中在较低的乙醇水平上，可能未能准确反映面对相关工业原料（300 – 800 mM）时的真实生物转化能力（Wang等人，2023年）。解决这一差异对于设计稳健的生物过程至关重要。此外，优化电子受体的使用——通常来自废物发酵的乙酸和丁酸（Wu等人，2024年）——仍然是一个挑战。特别是在高底物压力下，乙酸浓度对纯C. kluyveri培养物中CE动力学和产品选择性的确切影响仍需进一步探索。丁酸作为一种关键中间体，也可以作为EA（Wang等人，2024年）。尽管在混合培养中观察到乙酸-丁酸共用的协同效应，但目前还缺乏对不同受体组合如何影响纯C. kluyveri在高底物负荷下的产量、特异性和潜在代谢瓶颈的系统研究。

本研究通过使用先前未被表征的菌株Clostridium kluyveri CICC 24509，在工业相关的高底物负荷条件下评估己酸的生产情况，直接解决了这些知识空白。假设该菌株具有适合此类条件的强大特性，并且优化ED/EA的比例和组成可以提高己酸的生产效率。具体而言，本研究旨在：（1）确定使用乙酸作为EA时C. kluyveri CICC 24509的最佳乙醇浓度和耐受极限；（2）评估总碳负荷增加对产品分布和MCFA积累的影响；（3）独特地研究在这种纯培养系统中，与单一受体策略相比，乙酸和丁酸共用的潜在协同效益。所获得的见解为利用C. kluyveri高效升级高浓度有机废物流为有价值的己酸提供了关键指导。

部分摘要

菌株、培养基和培养条件

Clostridium kluyveri CICC 24509来自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC，北京）。每升去离子水中的培养基含有：0.2 g MgSO₄·7H₂O、0.3 g K₂HPO₄、5.0 g CaCO₃、0.5 g (NH₄)₂SO₄、2.5 g NaHCO₃·7H₂O、5.0 g CH₃COONa和5.0 g酵母提取物。初始pH值使用1 M NaOH调整至6.8。然后将培养基分装到工作体积为100 mL的150 mL血清瓶中。每个瓶子用N₂冲洗

乙醇浓度影响己酸生产并显示C. kluyveri CICC 24509的高耐受性

首先研究了初始乙醇浓度（5–25 g L^-1）对C. kluyveri CICC 24509产生己酸的影响，同时保持乙酸浓度恒定为5 g L^-1（图1）。前96小时内的底物消耗和己酸生产速率总结在表S2中。最初，乙醇和乙酸都被迅速消耗，导致立即产生己酸作为唯一的MCFA，没有明显的滞后阶段。己酸浓度在96小时时达到峰值

结论

本研究成功使用Clostridium kluyveri CICC 24509从高浓度底物中优化了己酸的生产。最佳性能需要高乙醇浓度（20 g L^-1），这表明该菌株具有显著的耐受性。关键的是，使用乙酸和丁酸作为共电子受体可以协同增强链延长作用，克服了单一受体的限制，实现了高己酸浓度（16.0 g L^-1）和生产速率（4.0 ± 0.1 g L^-1 d^-1）。

作者贡献声明

张宇彤：撰写——原始草稿、方法论、研究、概念化。陈川：资源提供。王雪婷：资源提供。邢德峰：资源提供。任楠琦：资源提供。赵雷：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：U22A20443、32570108、52300155）；黑龙江省优秀青年学者自然科学基金（项目编号：YQ2023C031）；城市水资源与环境国家重点实验室（哈尔滨工业大学）（编号：2024TS22）；污泥安全处置与资源化国家工程研究中心科学基金（哈尔滨工业大学）（编号：Z2024001）的支持