胸腺素α1通过抑制牙髓细胞铁死亡缓解牙髓炎的作用与机制研究

《International Journal of Oral Science》：Thymosin α1 alleviates pulpitis by inhibiting ferroptosis of dental pulp cells

本研究针对牙髓炎治疗难题，聚焦新型细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）在牙髓炎中的作用机制。研究人员通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）揭示牙髓炎组织细胞异质性，发现铁死亡关键标志物GPX4低表达、PTGS2高表达。体外实验证实胸腺素α1（Ta1）可逆转LPS诱导的牙髓细胞铁死亡，降低炎症因子；大鼠模型显示其前体PTMA能有效缓解牙髓炎症。该发现为靶向铁死亡治疗牙髓炎提供新策略。

　　

当牙齿的硬组织——牙釉质和牙本质因龋齿、外伤或细菌入侵而受损时，细菌便会乘虚而入，侵袭牙髓组织，引发牙髓炎。这是一种常见的口腔疾病，其典型特征包括牙髓充血、水肿以及大量炎症细胞浸润。随着炎症进展，牙髓组织甚至可能坏死，给患者带来剧烈疼痛和显著不适。传统上，牙髓炎的治疗多侧重于控制感染和消除炎症，但其深层机制，尤其是细胞死亡的特定形式在疾病进展中的作用，尚不十分明确。近年来，一种新型的、铁依赖性的程序性细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）——在生物医学研究领域引起了广泛关注。它与细胞凋亡、焦亡和坏死截然不同，其标志是铁依赖性脂质过氧化物的累积，这些过氧化物会破坏细胞膜，最终导致细胞死亡。更值得注意的是，铁死亡与炎症反应关系密切，二者可相互促进，形成恶性循环。然而，铁死亡是否在牙髓炎中扮演重要角色，以及能否通过干预铁死亡来治疗牙髓炎，仍是悬而未决的关键科学问题。为此，发表在《International Journal of Oral Science》上的这项研究，旨在深入探究牙髓炎中的铁死亡现象，并评估免疫调节肽胸腺素α1（Thymosin α1, Ta1）通过抑制铁死亡缓解牙髓炎的潜力。

为开展本研究，研究人员运用了多项关键技术：收集3例健康及3例牙髓炎患者拔除的第三磨牙组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析；利用脂多糖（LPS）体外刺激人牙髓细胞（DPCs）建立炎症模型；通过CCK-8法检测细胞活力，蛋白质印迹（Western blot）分析蛋白表达，荧光探针（DCFH-DA检测ROS，FerroOrange检测Fe²⁺，JC-10检测线粒体膜电位）评估铁死亡关键指标；构建大鼠牙髓炎模型（机械露髓后放置LPS明胶海绵），并局部应用PTMA（Ta1的前体）进行干预；对LPS刺激及Ta1处理的DPCs进行RNA测序（RNA-seq）以探索分子机制；使用免疫组织化学染色检测人及大鼠牙髓组织中GPX4和PTGS2的表达。

ScRNA-seq揭示健康与炎症牙髓的细胞多样性和异质性

研究人员首先利用单细胞RNA测序技术，对3例健康牙髓和3例牙髓炎组织进行了高精度解析。共捕获了40,231个细胞（牙髓炎17,814个，健康牙髓22,417个），并通过UMAP（均匀流形近似和投影）图谱将其可视化分为12个不同的细胞簇，包括巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、B细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、浆细胞、成纤维细胞、内皮细胞、间充质干细胞（MSC）、施万细胞（ScC）和非髓鞘形成施万细胞（nmScC）。

分析发现，在牙髓炎中，成纤维细胞的比例显著下降，而各类免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞等）则显著增加。差异表达基因（DEGs）分析显示，成纤维细胞中的DEGs数量最多。更重要的是，当将这些DEGs与铁死亡相关基因（FRGs）数据库（FerrDB）中的484个基因取交集时，发现在每个细胞簇的DEGs中均存在相当数量的差异表达铁死亡相关基因（DE-FRGs），这强烈提示铁死亡在牙髓炎中普遍发生。

牙髓炎中的铁死亡评估

为了进一步证实铁死亡的发生，研究人员检测了牙髓炎组织中的关键指标。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，铁死亡通路在成纤维细胞、巨噬细胞、MSC、中性粒细胞、nmScC和DPCs中均显著富集，其中氧化磷酸化通路最为富集，表明其在牙髓炎铁死亡中贡献显著。

实验结果显示，与健康牙髓相比，牙髓炎组织中的活性氧（ROS）和亚铁离子（Fe²⁺）水平显著升高。免疫组织化学染色进一步发现，牙髓炎组织中铁死亡的关键负调控因子谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达显著降低，而铁死亡标志物前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2，即COX-2）的表达则显著升高。这些结果从多个层面共同证实了铁死亡在牙髓炎中的确存在。

胸腺素α1对牙髓细胞铁死亡的影响

基于上述发现，研究转向探讨Ta1是否能抑制牙髓细胞的铁死亡。在LPS刺激的人牙髓细胞（DPCs）模型中，RNA测序的基因集富集分析（GSEA）证实了铁死亡的发生。Western blot结果显示，LPS刺激导致GPX4和铁蛋白轻链（FTL）蛋白表达下降，PTGS2蛋白表达上升；而添加Ta1后，能够逆转这种变化，即升高GPX4和FTL表达，降低PTGS2表达。当沉默DPCs中的Ptma基因（Ta1的前体蛋白基因）后，Ta1的保护作用被削弱。

在功能层面，FerroOrange探针检测发现Ta1能显著降低LPS刺激的DPCs内的Fe²⁺水平，效果与铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）类似。JC-10荧光探针检测线粒体膜电位的结果显示，Ta1能显著提高LPS刺激导致的降低的JC-10红/绿荧光比值，表明其能缓解线粒体膜电位的下降，从而抑制铁死亡。此外，Ta1还能显著降低LPS刺激的DPCs中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6的表达。

PTMA对大鼠牙髓炎的作用

为了在体内验证Ta1（通过其前体PTMA给药）的效果，研究人员建立了大鼠牙髓炎模型。通过在机械暴露的牙髓上放置LPS明胶海绵成功诱导了牙髓炎，表现为大量炎症细胞浸润。两种PTMA干预方式——将PTMA明胶海绵置于髓洞（LPS-P(gs)）或直接将PTMA注射入牙髓（LPS-P(i)）——均能显著减轻炎症细胞浸润。

同时，与LPS组相比，PTMA处理组（LPS-P(gs)和LPS-P(i)）大鼠牙髓组织中的Fe²⁺和ROS水平均显著降低。免疫组织化学染色结果与体外实验一致：LPS诱导的牙髓炎中GPX4表达降低，PTGS2表达升高；而PTMA处理则能显著增加GPX4阳性细胞百分比，降低PTGS2阳性细胞百分比。

胸腺素α1处理的炎症牙髓细胞的RNA-seq分析

为了深入探索Ta1缓解铁死亡的分子机制，研究人员对Control、LPS刺激以及LPS+Ta1处理的DPCs进行了RNA测序。主成分分析（PCA）显示，LPS+Ta1组的基因表达谱更接近于Control组，而与LPS组差异明显。

差异表达基因分析发现，LPS vs Control比较中有9095个DEGs，LPS+Ta1 vs LPS比较中有8584个DEGs，而LPS+Ta1 vs Control的DEGs数量显著减少，表明Ta1在很大程度上逆转了LPS引起的基因表达变化。将两组比较（LPS vs Control 和 LPS+Ta1 vs LPS）中共有的7307个DEGs与铁死亡相关基因取交集，发现有220个差异表达的铁死亡相关基因（DE-FRGs）。热图分析清晰地显示，在LPS刺激下上调的127个DE-FRGs和下调的93个DE-FRGs，在添加Ta1后，其表达趋势发生了逆转。这从转录组水平证实了Ta1能够显著逆转LPS刺激的DPCs中的铁死亡相关基因表达谱。

研究结论与意义

本研究通过整合单细胞测序、体外细胞模型、体内动物模型及转录组学分析，系统性地揭示了铁死亡在牙髓炎发生发展中的关键作用。研究首次绘制了人牙髓炎与健康牙髓的单细胞图谱，明确了牙髓炎中显著的细胞异质性变化，并提供了铁死亡发生的多维度证据。更重要的是，研究创新性地发现免疫调节肽胸腺素α1能够通过抑制牙髓细胞的铁死亡来缓解牙髓炎症。其作用机制可能与调节GPX4、PTGS2等铁死亡关键分子，降低细胞内Fe²⁺水平和ROS，稳定线粒体膜电位，以及下调TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子有关。RNA-seq结果进一步表明，Ta1能广泛逆转LPS刺激引起的铁死亡相关基因的表达紊乱。

该研究的重要意义在于：首先，它深化了对牙髓炎病理机制的理解，将铁死亡这一新型细胞死亡方式与牙髓炎症紧密联系起来，为认识该疾病提供了新视角。其次，研究首次探讨了胸腺素α1在牙髓炎治疗中的应用潜力，为开发靶向铁死亡的治疗牙髓炎的新策略提供了重要的临床前实验依据。胸腺素α1作为一种已知具有免疫调节功能的生物活性肽，其潜在的安全性为其临床转化带来希望。然而，研究也指出，由于牙髓炎中存在大量免疫细胞浸润，Ta1对这些免疫细胞的具体影响以及基于铁死亡的详细治疗策略仍有待未来研究进一步阐明。总之，这项研究不仅为牙髓炎的发病机制增添了新的重要内容，也为其治疗开辟了一条富有前景的新途径。