从肝素加工废水中提取猪小肠糖蛋白：结构表征与体外抗氧化活性研究及其在功能性食品中的应用潜力

本研究针对肝素加工废水资源浪费与环境污染问题，创新性地从猪小肠肝素加工废水中提取纯化糖蛋白（PSIG-1），通过系统优化提取工艺（0.3 mol/L NaOH，液固比1:20，60°C提取3.5 h），获得高纯度糖蛋白（蛋白含量83.52%，多糖含量12.42%）。结构分析表明PSIG-1具有O-糖肽键和吡喃糖构型，二级结构以无规卷曲为主。细胞实验证实PSIG-1能显著提升氧化损伤RAW264.7细胞的GSH-PX、SOD、CAT活性并降低MDA水平，展现出强抗氧化活性，为功能性食品开发提供新思路。

　　

随着生物医药产业的快速发展，肝素作为重要的抗凝血药物，其生产过程中产生大量高盐废水。这些废水中富含蛋白质、多糖等生物活性物质，若直接排放不仅造成资源浪费，还会对环境造成污染。目前，工业上主要采用酶法提取肝素，但废水处理问题尚未得到有效解决。猪小肠作为消化吸收和免疫的重要器官，含有丰富的生物活性物质，其中糖蛋白（Glycoproteins）因其多样的生物活性（如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等）而备受关注。然而，从肝素加工废水中回收糖蛋白并研究其结构与功能特性的系统研究仍较为缺乏。

为了解决这一问题，研究人员开展了一项创新性研究，旨在从猪小肠肝素加工废水中提取糖蛋白（Porcine Small Intestinal Glycoproteins, PSIG），并对其结构进行表征，同时评估其体外抗氧化活性。该研究不仅为废水资源化利用提供了新途径，还为功能性食品开发提供了潜在原料。相关成果发表在《Journal of Functional Foods》上。

研究人员通过优化碱性提取条件（0.3 mol/L NaOH，液固比1:20，60°C提取3.5 h），从冻干废水粉末中提取PSIG，提取率达到11.46%。随后采用DEAE-纤维素柱和Sephadex G-100柱层析进行纯化，获得主要组分PSIG-1。通过SDS-PAGE、化学组成分析、氨基酸和单糖组成分析、热稳定性分析、扫描电镜（SEM）、圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）等技术对PSIG-1进行了系统表征。此外，利用H₂O₂诱导的RAW264.7细胞氧化损伤模型，评估了PSIG-1的体外抗氧化活性，检测了细胞内丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。

3.1. PSIG的提取

通过单因素实验优化提取条件，发现液固比、提取时间、提取温度和NaOH浓度均对提取率有显著影响。最佳条件为：液固比20 mL/g，提取时间3.5 h，提取温度60°C，NaOH浓度0.3 mol/L，此时提取率达到11.46%。

3.2. PSIG的纯化

经DEAE-纤维素柱层析，获得三个洗脱峰（PSIG-1、PSIG-2和PSIG-3），其中PSIG-1的蛋白和多糖洗脱峰重叠良好，表明其主要为糖蛋白组分。进一步通过Sephadex G-100柱纯化，获得单一尖锐峰，证实PSIG-1纯度较高。

3.3. PSIG-1的一般分析

SDS-PAGE显示PSIG-1主要条带位于70 kDa，Coomassie Blue和PAS染色确认其为糖蛋白。化学组成分析表明PSIG-1的蛋白和多糖含量分别为83.52%和12.42%。氨基酸组成分析显示PSIG-1含有17种氨基酸，其中丝氨酸和苏氨酸含量较高，提示可能存在O-糖肽键。单糖组成分析表明PSIG-1主要由半乳糖胺、葡萄糖胺、半乳糖等组成。热稳定性分析（DSC）显示PSIG-1的热变性温度为127.4°C，表明其具有较高的热稳定性。SEM显示PSIG-1在低倍镜下呈粗糙层状结构，高倍镜下呈光滑球状或椭球状结构。

3.4. 结构表征

β-消除反应证实PSIG-1含有O-糖肽键。CD光谱分析表明PSIG-1的二级结构主要以无规卷曲（35.48%）为主，其次为β-折叠（30.71%）、β-转角（26.79%）和α-螺旋（7.04%）。FT-IR分析显示PSIG-1具有吡喃糖环构型（1077.5 cm^?1）。NMR分析进一步证实PSIG-1的糖链为β-吡喃糖构型，且不含α-糖苷键。

3.5. 体外抗氧化活性

细胞毒性实验表明PSIG-1在5–100 μg/mL浓度范围内对RAW264.7细胞无显著毒性。通过H₂O₂（0.2 mmol/L）诱导细胞氧化损伤模型，发现PSIG-1能显著降低细胞内MDA含量，提高GSH含量，并增强GSH-PX、SOD和CAT的活性，且效果呈剂量依赖性。尽管PSIG-1的抗氧化效果略低于维生素C（Vc），但其仍表现出显著的抗氧化能力。

本研究成功从猪小肠肝素加工废水中提取并纯化了糖蛋白PSIG-1，系统表征了其结构和功能特性。PSIG-1主要由70 kDa糖蛋白组成，具有O-糖肽键和β-吡喃糖构型，二级结构以无规卷曲为主。体外实验证实PSIG-1能有效缓解H₂O₂诱导的RAW264.7细胞氧化损伤，通过增强抗氧化酶活性和减少脂质过氧化产物MDA，展现出强大的抗氧化活性。这些发现不仅为肝素加工废水的资源化利用提供了新策略，还为PSIG-1作为功能性食品中的抗氧化剂提供了理论依据，具有重要的环境和经济意义。