阐明细菌内切几丁质酶催化域和几丁质结合域在抗癌特性中的功能意义

本研究针对细菌内切几丁质酶（ChiC）的抗癌机制尚不明确的问题，通过构建催化域突变体（W300P）和几丁质结合域（CBD）缺失突变体，系统评估了其对MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果表明，ChiC的抗癌活性依赖于其催化活性和CBD结构域，这为开发新型酶疗法提供了重要理论基础。

　　

几丁质酶（Chitinases）是一类能够水解几丁质（chitin）——自然界中含量仅次于纤维素的第二大多糖——的酶类，广泛存在于细菌、真菌、昆虫和哺乳动物中。近年来，研究发现某些微生物来源的几丁质酶不仅参与几丁质的降解，还能通过与硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）等糖类相互作用，影响细胞粘附、迁移甚至癌症进展。其中，来自沙雷氏菌（Serratia marcescens）的内切几丁质酶C（ChiC）因表现出显著抗肿瘤活性而备受关注，但其分子机制，尤其是其多个结构域（包括催化域、纤维连接蛋白III型域FNIII和几丁质结合域CBD）在抗癌过程中的具体作用，仍不明确。

为此，Ankita Shrivastava、Manik Goel、Md Fahim Khalid等研究人员在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》发表了一项深入研究，系统探讨了ChiC的催化活性和CBD在其抑制乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭中的功能。该研究通过理性设计点突变和结构域缺失突变体，结合分子对接、酶活分析、细胞功能实验和分子表达检测，首次揭示ChiC的抗癌效应高度依赖于其催化活性与底物结合能力的协同作用。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用NCBI数据库和Clustal ω进行ChiC序列与结构域分析；通过定点突变和基因克隆构建ChiC突变体（包括催化失活突变W300P、CBD缺失突变等）；使用Ni-NTA亲和层析和FPLC纯化重组蛋白；以4MU标记的几丁质衍生物为底物测定酶活；借助分子对接（SWISS DOCK）分析突变体与底物的相互作用；采用MTT/WST-1法、克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell小室实验评价细胞增殖、迁移与侵袭；通过流式细胞术分析细胞周期；使用qPCR和Western blot检测上皮-间质转化（EMT）标记物（E-cadherin、Vimentin）及细胞增殖相关蛋白（pERK1/2、Cyclin B1、SMP30）的表达。所有细胞实验均以人乳腺癌MCF-7细胞为模型，并设HEK293正常细胞为对照。

3.1. Construction of ChiC mutants

通过序列与结构分析，研究人员发现ChiC包含催化域（11–328）、FNIII域（340–425）和CBD域（435–480），且在多个物种中均存在高度保守的色氨酸300（W300）。该残基虽不位于催化保守基序DXXDXDXE中，但分子对接显示其与底物几丁二糖形成关键氢键。为此，团队构建了W300Y、W300P、W300A等一系列点突变体，并证实W300P突变导致酶活完全丧失。此外，还成功构建了缺失CBD的ChiC突变体（WT ChiC w/o CBD、W300P w/o CBD），用于后续功能比较。

3.2. Production of purified recombinant WT ChiC and its mutants

所有突变体与野生型ChiC均在E. coli中成功表达并纯化，SDS-PAGE显示预期条带（WT与W300P约为52 kDa，缺失CBD突变体约为41 kDa）。酶活测定证实WT ChiC与WT ChiC w/o CBD仍具有水解活性，而W300P及其缺失CBD突变体则完全失活。

3.3. Effects of ChiC mutant proteins on cell viability

MTT与WST-1实验表明，WT ChiC可浓度依赖性地抑制MCF-7细胞活力，而对非癌HEK293细胞无影响。催化失活突变体（W300P）或缺失CBD突变体（WT ChiC w/o CBD）抑癌效果显著减弱，尤其是双缺失突变体（W300P w/o CBD）几乎无效。

3.4. Effects on the clonogenic property of MCF-7 cells

克隆形成实验进一步显示，WT ChiC处理使MCF-7细胞集落形成减少53%，而WT ChiC w/o CBD仅部分抑制，W300P突变体则无显著效果，说明催化活性和CBD共同决定其抗增殖潜力。

3.5. Effects on the migratory and invasive nature of MCF-7 cells

划痕实验与Transwell实验结果表明，WT ChiC显著抑制MCF-7细胞的迁移与侵袭，而WT ChiC w/o CBD效果减弱，W300P突变体则与对照组无差异。说明ChiC的抗迁移与抗侵袭功能严格依赖其催化活性，而CBD起到辅助增强作用。

3.6. WT ChiC inhibited the Epithelial-Mesenchymal transition

通过qPCR和Western blot检测EMT标志物发现，WT ChiC上调上皮标志物E-cadherin、下调间质标志物Vimentin，而突变体无此效应，表明ChiC可通过抑制EMT进程阻遏肿瘤转移。

3.7. Modulation of cell cycle dynamics by ChiC and its mutants

流式细胞术显示，WT ChiC引起G2/M期阻滞，并下调细胞周期蛋白Cyclin B1表达；而W300P突变体反而促进S期进程，说明其催化活性直接干预细胞周期调控。

3.8. Effects on cell proliferation

Western blot分析表明，WT ChiC下调磷酸化ERK1/2（pERK1/2）并上调SMP30（衰老标记蛋白30），两种变化均与抑制增殖相关；而突变体则作用相反或无影响，再次印证催化域和CBD在调控增殖信号通路中的必要性。

4. Discussion

本研究通过多角度功能分析，系统阐明ChiC的抗癌效应需同时依赖其催化活性和CBD介导的底物结合。分子机制上，ChiC可能通过水解肿瘤细胞表面的类几丁质糖链（如HS），干扰其与生长因子受体的相互作用，进而阻遏ERK通路活化、诱导细胞周期阻滞、抑制EMT进程。这一发现不仅深化了对微生物几丁质酶抗肿瘤机制的理解，也为开发新型酶类抗癌药物提供了关键分子依据。

5. Conclusion

该研究成功揭示ChiC催化域中W300残基及CBD结构域在抑制肿瘤增殖、迁移与侵袭中的不可或缺的作用，为后续优化酶疗法、设计功能增强型突变体以及探索其与现有药物的联合治疗策略奠定基础。未来研究需进一步开展体内实验，明确ChiC在肿瘤微环境中的具体作用靶点及免疫调节潜力。