基于微滴数字PCR（ddPCR）的烟草疫霉基因组DNA标准物质开发及其精准定量应用研究

本研究开发了一种基于微滴数字PCR（ddPCR）的烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）基因组DNA标准物质（RM），通过光学显微镜精准校准微滴体积，获得SI可溯源的拷贝数定值（(4.6 ± 0.5) × 105 copies/μL，k=2）。该RM具有良好的均匀性与稳定性，为植物病原体分子检测提供标准化工具，显著提升qPCR定量准确性、实验室内外可比性及病害监测可靠性。

　　

Section snippets

Preparation of reference materials

烟草疫霉（P. nicotianae）致病菌株源自中国农业科学院烟草研究所。所有分离株在20°C黑暗条件下于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养。使用商业DNA提取试剂盒（天根，中国）从菌丝体和植物根系中提取基因组DNA（gDNA），按说明书操作。DNA样品分装为200单位并储存于?70°C直至使用。

Digital PCR method

烟草疫霉的ITS序列被选作ddPCR定量靶标。

Droplet volume measurement

采用DG8?手动微滴生成器成功制备单分散水包油乳液，用于测定ddPCR中的微滴体积。显微镜观察显示微滴均匀呈球形，经示意图标注边界（图1a, b）。对至少2385个有效微滴的统计分析显示，微滴直径和体积均呈正态分布（图1c, d）。

Conclusion

烟草疫霉是一种破坏性极强的土传植物病原体，造成重大农业损失。尽管qPCR广泛应用于病原体检测，但缺乏标准化参考材料阻碍了其绝对定量的准确性与可比性。本研究开发并表征了一种计量学可溯源的gDNA RM，通过ddPCR结合微滴体积校正实现定值。该RM表现出良好的性能。