基于完整质量、中下层和从头底层质谱联用的多克隆抗体高通量测序技术研究

本研究针对多克隆抗体(pAb)复杂混合物难以测序的挑战，开发了PolySeq.AI自动化从头测序工作流。该技术整合完整质量、中下层和从头底层质谱数据，在不依赖外部数据库的情况下，对HB-95细胞系mAb混合物和四株mAb混合样本实现了>99%的测序准确率。研究成果为pAb的精准表征和重组抗体开发提供了全新解决方案，对推动抗体药物研发具有重要意义。

　　

在生物医药领域，抗体药物已成为治疗癌症、自身免疫性疾病等的重要武器。其中，单克隆抗体(mAb)因其批次间一致性高而占据主导地位，但多克隆抗体(pAb)具有靶向病原体多个表位的独特优势，对病毒突变具有更强抵抗力。然而，pAb的复杂混合物特性使其序列解析一直是个巨大挑战，这严重限制了其治疗潜力的发挥。

目前pAb测序方法大多需要种系数据库或B细胞测序数据支持，但由于抗体的高度可变性以及B细胞不可获得的情况，迫切需要一种纯粹基于质谱技术的从头测序解决方案。正是为了解决这一关键技术瓶颈，来自加拿大安大略省生物信息学解决方案公司的研究团队开展了这项创新性研究。

研究人员开发了名为PolySeq.AI的自动化从头测序工作流，该技术整合了完整质量、中下层和底层质谱分析三个层面的数据。通过创新性地结合不同层级的质谱信息，该工作流实现了从肽段到蛋白质水平的序列信息累积，最终达到完全覆盖和高精度测序的目标。

在技术方法上，研究团队首先对抗体样本进行去糖基化处理，然后使用IdeS或SpeB蛋白酶在铰链区切割，获得F(ab)_{2和Fc片段，进一步还原得到轻链(LC)、Fd和Fc/2亚基。完整质量分析采用滑动窗口算法进行去卷积处理，中下层质谱采用靶向采集策略，底层质谱则通过多种酶解方式增加肽段重叠度。测序算法基于动态规划原理，结合肽段重叠图和中下层碎片离子匹配进行序列组装。}

研究结果首先在HB-95细胞系实验中得到验证。完整质量分析成功识别出三种主要抗体形式，包括一个双特异性抗体。测序结果显示，两个轻链和一个重链均达到完全底层覆盖，中下层覆盖率分别为55.84%、41.28%、61.68%和64.65%。通过BLAST比对，测序结果与蛋白质数据库中的已知序列完全匹配，特别是LC2和HC可变区与W6/32商业化抗体的序列一致。

在四株mAb混合实验（贝伐珠单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗按3:2:1:1混合）中，PolySeq.AI成功测序所有抗体链，准确率达到99-100%。尽管输入比例与检测到的丰度存在差异（如利妥昔单抗和曲妥珠单抗Fd亚基的相对丰度分别为28.14%和5.25%），但软件仍能准确识别低至5%丰度的亚基。

功能验证方面，研究人员利用测序结果成功表达重组抗体，并通过Western blot和免疫肽组学分析证实了其对HLA-I复合物的完整结合能力。免疫沉淀实验显示明显的HLA-I重链条带，洗脱肽段的长度分布特征也与HLA-I肽段相符，充分证明了测序抗体的功能完整性。

研究讨论部分指出，与传统方法相比，PolySeq.AI的真正创新在于其完全不依赖基因或蛋白质数据库的纯粹从头测序特性。该方法通过多层级质谱数据整合，有效解决了pAb测序的复杂性难题。虽然当前方法在低丰度抗体检测方面还存在一定局限，但通过亲和纯化、分级分离等技术改进，有望进一步拓展其应用范围。

这项研究的重要意义在于为pAb的精准表征提供了可靠技术平台，为重组多克隆抗体的开发奠定了坚实基础。随着技术的不断完善，PolySeq.AI有望在ELISA检测、抗蛇毒血清、狂犬病疫苗等广泛应用中发挥重要作用，推动多克隆抗体在诊断和治疗领域的创新应用。

该研究成果发表于《Molecular & Cellular Proteomics》期刊，为抗体药物研发领域提供了重要的技术突破，标志着多克隆抗体研究进入了新的发展阶段。通过这项研究，我们看到了质谱技术在复杂蛋白质混合物分析中的巨大潜力，也为未来抗体工程的精准设计开辟了新的可能。