谐肽肽库技术实现生物标志物检测中生物流体的优化选择与跨基质标准化分析

本研究针对生物标志物开发初期生物流体选择不确定的难题，建立了一种基于质谱的并行处理尿液、血浆和血清样本的工作流程，通过构建谐肽肽库实现跨生物流体的标准化定量比较。研究人员开发了交互式数据库“CATalog”，为蛋白在健康猫不同生物流体中的相对丰度提供参考，证明尿液在特定情况下可替代血液检测血液来源蛋白，为无创生物标志物检测提供了新策略。该研究发表于《Molecular & Cellular Proteomics》，对推动临床检测 assay 开发具有重要意义。

　　

在精准医疗的时代，生物标志物的发现与验证是连接基础研究与临床应用的桥梁。理想的生物标志物检测应当基于易于获取的生物流体，如血液或尿液，以实现微创甚至无创的疾病监测。然而，在生物标志物研究的初始阶段，一个关键且常常被忽视的问题是：究竟应该选择哪种生物流体作为检测样本？尿液、血浆还是血清？传统的蛋白质组学研究通常将不同生物流体分开处理和分析，这使得不同基质中的蛋白质测量结果难以直接比较，研究人员往往只能依据有限的文献或经验做出选择，这无疑增加了后续 assay 开发失败的风险。

为了解决这一难题，由 Katelyn B. Brusach、Ariana E. Shannon、Alex W. Joyce、Jessica M. Quimby 和 Brian C. Searle 组成的研究团队在《Molecular & Cellular Proteomics》上发表了一项创新性研究。他们开发了一套基于质谱的完整工作流程，能够对配对的尿液、血浆和血清样本进行并行处理、分析和比较。该研究的核心在于创建了“谐肽肽库”，使得在不同生物流体中能够监测一致的肽段和碎片离子，从而实现跨流体的标准化和定量比较。此外，团队还建立了一个名为“CATalog”的交互式数据库，为研究人员根据蛋白质在健康个体不同生物流体中的相对丰度来选择最佳检测样本提供了直观的工具。令人惊喜的是，他们的结果表明，如果处理方法得当，尿液有时能够很好地反映血液中的蛋白质信息，这为无需静脉穿刺或去除高丰度蛋白的无创检测开辟了新的可能性。

为了开展这项研究，研究人员首先收集了8只健康客户拥有的猫的配对尿液、血清和血浆样本。考虑到配对人类对照样本获取困难，而小鼠尿液体积太小，他们选择猫作为模型。样本经过基质特异性的前处理：尿液采用丙酮沉淀以去除盐分并浓缩蛋白质，而血浆和血清则采用高氯酸沉淀结合HLB固相萃取来去除高丰度蛋白和盐分。此后，所有样本并行进行蛋白质浓度定量、还原烷基化、酶切和除盐。在数据采集方面，研究采用了高分辨率质谱仪（Orbitrap Exploris 480）结合数据非依赖采集（DIA）模式，对每个生物流体的混合样本池进行深度分析以构建色谱图库。最关键的数据处理环节，研究人员利用他们开发的软件EncyclopeDIA的新功能，将不同生物流体的肽库进行“谐化”。这一步骤在全球水平控制假发现率（FDR），为每个肽段选择在所有基质中干扰最小的最佳定量碎片离子，并保留生物流体特异性的保留时间，最终生成可用于并行搜索和可比定量分析的谐肽肽库。

比较基质、蛋白质和生物流体间的定量替代性

研究人员首先评估了不同生物流体中蛋白质组的重叠情况。结果显示，尿液中共鉴定到1920种蛋白质，血浆中680种，血清中726种。其中，有574种蛋白质在所有三种生物流体中均被定量。特别值得注意的是，尿液不仅包含了大量独特的蛋白质（1232种），还与血液生物流体共享了相当数量的蛋白质（例如，418种蛋白质在三者中均有）。主成分分析（PCA）表明，尿液蛋白质组与血清和血浆蛋白质组明显区分，而血清和血浆的蛋白质组则较为相似，难以区分。这表明，虽然整体蛋白质组不同，但许多个体蛋白质可以在多种生物流体中被检测到。更重要的是，通过比较蛋白质的相对丰度，研究发现许多蛋白质在尿液中的信号强度高于在血液中。例如，转化生长因子β受体1（TGFBR1）在尿液中的相对强度最高，而生长分化因子10（GDF10）则在血浆中信号最强。这证明了根据目标蛋白质选择最适生物流体的必要性和可行性。

生物流体数据库（CATalog）的开发

基于上述可比对的定量数据，研究团队开发了名为“CATalog”的交互式数据库。该数据库使用R语言的Shiny框架构建，包含了1949种蛋白质在尿液、血浆和血清中的相对强度信息。用户可以通过蛋白质名称、基因名或基因本体论（GO）注释进行搜索。对于任一选定的蛋白质，数据库会以箱线图形式直观展示其在三种生物流体中的相对强度分布，并标记出信号最强的生物流体。此外，还提供蛋白质的详细功能注释。为了验证数据库的实用性，研究人员进行了一项靶向质谱实验，选择了10种蛋白质，包括常用的内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。CATalog预测GAPDH在尿液中相对强度最高，血清次之，血浆最低。随后的平行反应监测（PRM）靶向验证实验完美地重复了这一趋势，证明了CATalog所提供数据的可靠性。

CATalog的应用：为生物标志物发现提供信息化的生物流体选择

最后，研究团队在猫慢性肾脏病（CKD）的背景下展示了CATalog的实际应用价值。他们选择了两个与CKD相关的潜在生物标志物：视黄醇结合蛋白4（RBP4）和瘦素（Leptin）。在CATalog中查询RBP4，结果显示其在血清和血浆中的丰度远高于尿液，这与文献报道一致。随后的靶向PRM实验在5只CKD猫和5只健康猫中进行，发现RBP4在血浆中能够显著区分患病与健康个体（p = 0.005），而在血清中则无显著差异（p = 0.613）。对于瘦素，CATalog显示其在血浆中的测量变异性远小于血清，提示血浆可能提供更可靠的统计效能。靶向实验证实，瘦素在血浆中能显著区分CKD和健康状态（p = 0.027），而在血清中则不能（p = 0.886）。这两个例子表明，CATalog不仅能反映已知的生物学知识，还能通过展示测量变异性等数据，指导研究人员选择在特定疾病背景下统计效力更高的生物流体进行 assay 开发。

本研究成功建立了一套能够对尿液、血浆和血清进行并行处理和可比对分析的质谱工作流程，其核心创新在于“谐肽肽库”的构建和计算方方法。CATalog数据库的建立，为生物标志物研究初期选择最佳生物流体提供了宝贵的实证数据资源。研究结果有力地表明，尿液是一个尚未被充分开发的生物标志物“宝库”，其蛋白质组深度甚至超过经过处理的血液样本。更重要的是，由于肾脏的天然“过滤”作用，尿液中含有大量血液来源的蛋白质，且通常信号强度更高，这意味着在某些情况下，尿液可以作为一种更易于获取、无需复杂前处理的替代性检测样本，来反映血液循环中的蛋白质信息。这项研究不仅为生物标志物的开发和转化提供了强有力的技术支撑和资源平台，也挑战了传统上过度依赖血液样本的思维定式，强调了基于目标蛋白质特性进行理性生物流体选择的重要性，对推动微创/无创临床检测的发展具有深远意义。