多囊蛋白1/2相互作用组学揭示BLOC-1/BORC溶酶体定位复合物在常染色体显性多囊肾病中的新功能

本研究针对常染色体显性多囊肾病（ADPKD）致病基因PKD1/PKD2编码的多囊蛋白1/2（PC1/PC2）功能机制不清的问题，通过邻近标记技术（BioID）系统绘制了PC1-C末端和PC2在全细胞条件下的相互作用网络，发现172个共同相互作用蛋白，并首次揭示PC1与溶酶体定位复合物BLOC-1/BORC的相互作用。研究证实BLOC-1/BORC共定位于纤毛和溶酶体，调控PC1的纤毛定位，其缺失会导致溶酶体分布异常并促进囊肿形成，而PC1-C末端表达可逆转此表型。该成果为阐明ADPKD发病机制提供了重要分子资源。

　　

在肾脏疾病的研究领域，常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是一种常见且可能致命的单基因遗传病，其特征是肾脏中充满液体的囊肿进行性形成，最终导致肾功能衰竭。这种疾病主要由PKD1或PKD2基因的突变引起，这两个基因分别编码多囊蛋白1（PC1）和多囊蛋白2（PC2）。尽管科学家们已经知道PC1和PC2在肾脏上皮细胞的纤毛、细胞膜和内质网等处形成复合物，并参与钙信号传导、机械感觉和细胞稳态的调节，但它们精确的分子功能以及在ADPKD中功能是如何被破坏的，至今仍不清楚。这就像我们知道锁和钥匙有关，却不太明白它们是如何配合开锁的，以及当锁坏了该怎么办。因此，深入揭示PC1和PC2的相互作用网络，对于理解ADPKD的发病机制、寻找新的治疗靶点至关重要。

为了解开这个谜团，由Fatima Lukmani、Jonathan M. Shillingford等研究人员组成的研究团队在《Molecular Cell》上发表了一项重要研究。他们采用了一种名为邻近依赖性生物素标识（BioID）的高通量蛋白质组学技术，系统地绘制了PC1的C末端片段（PC1-CTT）和全长PC2蛋白在细胞周期和纤毛形成条件下的蛋白质相互作用“地图”。

研究人员运用了多项关键技术方法：利用BioID技术结合质谱分析，绘制PC1-CTT和PC2的邻近相互作用组；通过细胞培养（包括人胚胎肾细胞HEK293、人视网膜色素上皮细胞、小鼠内髓集合管细胞以及来自正常人和ADPKD患者的永生化肾上皮细胞）进行功能验证；采用免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像和邻近连接 assay（PLA）进行蛋白质定位和相互作用的验证；通过shRNA/siRNA介导的基因敲低和CRISPR-Cas9介导的基因敲除，在细胞模型中研究特定基因的功能缺失效应；并建立三维（3D）Matrigel囊肿形成模型，模拟体内囊肿发育过程，评估基因功能对囊肿发生的影响。

研究结果

生成和验证PC1-CTT、PC2及对照细胞系

研究人员成功构建了膜锚定的PC1-C末端与BirA生物素连接酶融合的稳定细胞系（PC1-BF），以及PC2的N端或C端与BirA融合的细胞系（FB-PC2和PC2-BF）。验证表明，这些融合蛋白能够正确表达、生物素化并定位于预期的细胞区域（如PC1-BF定位于质膜和细胞内斑点状结构，PC2-BF/FB-PC2主要定位于内质网），并且PC1-BF保留了诱导肾小管样结构形成的能力，说明其具有功能性。

PC1-B和PC2相互作用组的全局概览

通过BioID和SAINTexpress统计分析，研究人员鉴定出PC1-BF有507个高置信度相互作用蛋白，PC2-BF/FB-PC2分别有379个和257个（约70%重叠）。值得注意的是，约50%的PC1-BF相互作用蛋白也与PC2数据集重叠，这反映了PC1和PC2功能的相互依存性。基因本体（GO）富集分析显示，PC1的相互作用蛋白富集于内质网、溶酶体、线粒体和囊泡膜等细胞器，功能上涉及自噬调节、脂质信号、内质网应激、内质网栓系和囊泡运输等。研究还鉴定出18个与PC1/2或多囊肾病相关的已知或预测相互作用蛋白，验证了该方法的可靠性。

纤毛诱导/血清剥夺条件下富集的PC1-BF相互作用组

在诱导细胞纤毛形成（血清剥夺）的条件下，PC1-BF的相互作用组发生了显著变化，鉴定出许多新的高置信度相互作用蛋白，特别是与纤毛组件/调节因子（如ARL13B, TULP3等）以及LAMTOR1网络相关的蛋白。其中最突出的发现是鉴定出BLOC-1复合物的所有组分和BORC复合物的7个亚基。BLOC-1和BORC共享三个组分，BORC负责调节溶酶体在细胞周边的定位。此外，还发现了Ragulator-Rag复合物组分以及其他与溶酶体定位相关的蛋白。与多个溶酶体蛋白质数据库的比较分析确认，PC1-BF相互作用组中溶酶体蛋白的比例显著高于PC2数据集。

BLOC-1/BORC与PC1的相互作用

通过免疫共沉淀（Co-IP）和邻近连接 assay（PLA）两种正交方法，研究人员验证了PC1与BLOC-1/BORC组分（BLOC1S2, BLOC1S4, SNAPIN）之间的特异性相互作用。在正常人肾上皮细胞（NHPTK RECs）中，PC1与BLOC1S1或SNAPIN的PLA信号显著高于阴性对照，证实了它们在内源性水平上的近距离关联。

BLOC-1/BORC组分与PC1在纤毛和溶酶体共定位的功能意义

研究发现，GFP标记的BLOC-1组分（BLOC1S2, BLOC1S4, DTNBP1, SNAPIN）和内源性PC1均定位于纤毛基部，并与过渡区标记物TCTN3共定位。当敲低或敲除BLOC-1/BORC组分（BLOC1S1, BLOC1S2, BLOC1S4, SNAPIN）后，不仅纤毛发生率和形态出现异常，PC1在纤毛基部的定位也显著减少或异常。同时，内源性标记显示PC1与BLOC1S1/2、SNAPIN在溶酶体（DQ-BSA标记）处存在共定位。功能上，敲低PC1或BLOC-1/BORC组分均会导致溶酶体分布异常，表现为在核周区域聚集，失去了正常的周边分布。

BLOC-1/BORC组分在ADPKD和3D小鼠囊肿模型中的功能相关性

在来自ADPKD患者（携带PC1-CTT截断突变Q4004X）的肾上皮细胞中，BLOC-1/BORC组分（BLOC1S1, BLOC1S2, SNAPIN, BORCS7）呈现出异常的核周聚集分布，与正常肾细胞相比存在明显差异。在3D Matrigel囊肿形成实验中，敲低PKD1、PKD2或BLOC-1/BORC组分（BLOC1S1, BLOC1S2, BLOC1S4）均会显著促进mIMCD-3细胞形成更多、更大的囊肿，而敲低已知的囊肿形成调节因子ANO6则抑制囊肿形成。更重要的是，在敲低BLOC-1/BORC组分的同时，异位表达膜锚定的PC1-CTT片段，可以挽救由BLOC-1/BORC缺失引起的囊肿形成表型，促使细胞倾向于形成管状结构而非囊肿。

研究结论与意义

这项研究通过大规模的蛋白质相互作用组学分析，首次系统描绘了PC1-C末端和PC2在接近生理状态下的相互作用网络，为理解多囊蛋白功能提供了宝贵的资源。研究的核心发现是揭示了PC1与溶酶体定位复合物BLOC-1/BORC之间存在前所未有的功能联系。

研究人员证实，PC1与BLOC-1/BORC在纤毛基部和溶酶体处存在共定位和相互作用，并且这种相互作用对于PC1正确的纤毛定位至关重要。当BLOC-1/BORC功能受损时，会导致PC1纤毛定位异常、溶酶体分布缺陷，并最终促进肾脏囊肿的形成。反之，在ADPKD患者来源的细胞中，由于PC1-CTT的缺失，也观察到了BLOC-1/BORC分布的异常。尤为重要的是，研究证明即使BLOC-1/BORC功能受损，单独表达PC1的C末端片段就足以部分逆转囊肿表型，这凸显了PC1-CTT片段的关键作用，并为基于此片段的潜在治疗策略提供了实验依据。

这项研究将多囊蛋白的功能与溶酶体定位和营养感应通路紧密联系起来，为理解ADPKD的发病机制开辟了新的视角。异常的代谢调节，特别是溶酶体信号通路，被认为是囊肿形成的重要驱动因素。PC1通过其C末端与BLOC-1/BORC等复合物的相互作用，可能扮演着整合细胞外部信号（如通过纤毛感知）与内部代谢状态（如通过溶酶体）的关键角色。当PC1功能丧失时，这种整合作用被破坏，可能导致溶酶体功能、自噬流和细胞增殖信号的失调，从而驱动囊肿发生。

综上所述，该研究不仅提供了一个丰富的PC1/2相互作用组数据集供后续深入挖掘，更重要的是发现了一个将多囊蛋白功能与溶酶体定位和细胞代谢联系起来的新机制。这为未来开发针对ADPKD及其他相关纤毛病的新疗法提供了重要的分子靶点和理论依据。