基于脱碱基位点的半线性预扩增技术提升低模板DNA的STR分型效率

本文针对法医遗传学中低模板DNA（LT-DNA）STR分型成功率低的难题，推荐一种创新性解决方案——脱碱基位点介导的半线性预扩增（abSLA PCR）。研究通过优化引物中脱碱基位点的位置（位于3'端第8-10碱基），结合B家族DNA聚合酶（如Phusion）的跨损伤合成阻滞特性，实现了高保真度的靶标富集。实验表明，该方法与Identifier Plus试剂盒联用，可在6.25 pg基因组DNA或单细胞样本中显著提高STR位点检出率，且不增加stutter峰等人工假象，为法医微量DNA分析提供了新策略。

　　

在法医DNA鉴定领域，短串联重复序列（STR）分型是个体识别和亲子鉴定的金标准。然而，当面对犯罪现场遗留的微量生物样本（如单个细胞或皮屑）时，传统STR分析技术常因DNA模板量过低（低模板DNA，LT-DNA）而遭遇瓶颈。LT-DNA分析中的随机效应（如等位基因丢失、stutter峰增高）严重干扰结果判读，且样本不可复得的特性要求首次检测必须成功。现有全基因组扩增（WGA）等方法存在扩增偏倚和重复性差的问题，亟需开发兼顾高灵敏度与高保真度的新技术。

针对这一挑战，复旦大学基础医学院谢建辉团队在《Scientific Reports》发表研究，提出一种基于脱碱基位点（abasic site）的半线性预扩增方法（abSLA PCR）。该方法通过巧妙设计引物，在STR分型前对靶标区域进行特异性富集，显著提升LT-DNA的分析效能。

关键技术方法

研究通过以下核心实验验证abSLA PCR的可行性：

1. 1.
   引物设计优化：合成含脱碱基位点的引物，系统评估其位于3'端不同位置（第4、6、8、10碱基）对扩增效率的影响；
2. 2.
   聚合酶筛选：比较Taq（A家族）与Phusion、PrimeSTAR GXL、KAPA HiFi（B家族）DNA聚合酶的跨损伤合成能力；
3. 3.
   灵敏度验证：使用4-plex STR系统（D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO）耦合Identifier Plus试剂盒，检测6.25 pg~50 pg基因组DNA及单细胞样本；
4. 4.
   性能评估：通过毛细管电泳分析位点检出率、峰高比（PHR）和stutter比率等指标。实验样本包括健康志愿者血液提取的基因组DNA（经伦理审批）和口腔脱落细胞。

研究结果

1. 脱碱基位点引物可阻断B家族DNA聚合酶延伸

通过引物延伸实验证实，Phusion等B家族DNA聚合酶在遇到引物3'端第8-10碱基处的脱碱基位点时延伸停滞，产生预期长度的截短产物（338 bp），而Taq聚合酶则出现跨损伤合成现象。

2. 脱碱基位点位于第8-10碱基时扩增效率最优

qPCR与毛细管电泳结果显示，当脱碱基位点位于引物3'端第8-10碱基时，扩增效率显著高于第4或6碱基（P<0.05），且对退火温度（55~65°C）不敏感。

3. abSLA预扩增提升低模板DNA的STR分型成功率

在25 pg DNA输入量下，abSLA联合Identifier Plus试剂盒的STR位点检出率达95.0±2.76%，显著高于直接分组（P<0.01）。且stutter比率稳定在10.34~12.39%，未因循环数增加而升高。

4. 单细胞STR分型证实方法可靠性

单细胞实验中，1-3个细胞样本的STR位点平均检出率为75~90.63%， heterozygous峰高比>50%，表明方法可有效规避采样随机性带来的等位基因丢失。

结论与展望

本研究开发的abSLA PCR技术通过将脱碱基位点引入单一引物，实现了STR靶标的半线性扩增，兼具高灵敏度（可检测6.25 pg DNA）与高保真度（低stutter比率）。其创新性在于利用B家族DNA聚合酶的特性精准控制扩增模式，避免指数扩增带来的误差累积。该方法与主流商业STR试剂盒（如Identifier Plus、PowerPlex 21）兼容，为法医微量样本、循环肿瘤细胞等LT-DNA场景提供了实用化解决方案。未来通过优化缓冲体系（如添加BSA）或联合新型检测技术，有望进一步提升复杂样本的分析精度。