单细胞RNA测序与孟德尔随机化揭示牙周炎免疫相关基因的分子机制及因果关联

本研究通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与孟德尔随机化（MR）技术，系统揭示了牙周炎发病过程中免疫细胞与关键枢纽基因（hub genes）的因果关联。研究人员鉴定出ANXA1、SLC11A1等7个核心调控基因，发现其通过PI3K-AKT-mTOR、IL6-JAK-STAT3等信号通路调控免疫细胞浸润，为牙周炎的免疫干预提供了新靶点。该研究发表于《Scientific Reports》，为理解牙周炎免疫机制提供了重要见解。

　　

牙周炎作为一种慢性炎症性疾病，影响着全球近半数人口，被列为世界第六大流行疾病。这种由微生物群落失调介导的疾病，会导致牙周组织进行性破坏，并伴随大量免疫细胞浸润。尽管研究表明免疫失调在牙周炎发病机制中起关键作用，但免疫细胞亚型与核心调控基因之间的因果关系尚未明确，这限制了针对性治疗策略的发展。

传统研究方法往往难以建立免疫细胞亚型与核心调控基因间的可靠联系，且缺乏稳健的因果推断验证。为突破这些局限，邱雪迪等研究人员在《Scientific Reports》上发表了创新性研究，首次将单细胞RNA测序（scRNA-seq）与孟德尔随机化（MR）方法相结合，深入探讨了牙周炎中免疫相关基因的分子机制和因果关联。

关键技术方法

研究整合了多个数据库资源：从GEO数据库获取单细胞RNA测序数据（GSE174609）和微阵列表达谱（GSE156993）；从eQTLGen联盟获取表达数量性状位点（eQTL）数据；从芬兰FinnGen联盟获取牙周炎全基因组关联研究（GWAS）数据（3,046病例vs 195,395对照）。主要技术包括：单细胞RNA序列分析（Seurat框架）、孟德尔随机化分析（IVW、MR-Egger等方法）、基因集富集分析（GSEA/GSVA）、细胞通讯分析（CellChat）和免疫浸润分析（ssGSEA）。

单细胞表达谱数据

研究人员分析了8个牙周组织样本的单细胞RNA测序数据，经过严格质量控制后，获得66,209个高质量细胞。UMAP降维分析揭示了18个明确的细胞亚群，进一步细分为23个不同的免疫细胞簇，包括CD4⁺T细胞（初始和成熟）、CD8⁺T细胞（初始和效应器）、B细胞群体（初始和分化）、自然杀伤细胞、单核细胞、树突状细胞和造血祖细胞。

差异基因表达分析确定了7个关键枢纽基因：ANXA1、ARL4C、CD79B、LRRC25、NKG7、SLC11A1和VIM，这些基因在牙周炎免疫细胞亚群中表现出特异性表达模式。

孟德尔随机化分析

通过四种MR方法（逆方差加权IVW、MR-Egger回归、加权中位数估计和MR-PRESSO）的一致性分析，研究发现7个基因与牙周炎发病风险存在显著因果关系。NKG7（OR=0.821）、ARL4C（OR=0.861）、CD79B（OR=0.791）、VIM（OR=0.839）和LRRC25（OR=0.914）与牙周炎风险降低相关，而SLC11A1（OR=1.131）和ANXA1（OR=1.126）则增加患病风险。

敏感性分析显示，排除任何单个SNP（单核苷酸多态性）均不会显著影响总体效应估计，证实了这7个基因因果关系的稳健性。

关键基因相关信号通路

通路富集分析揭示了7个枢纽基因参与的关键信号通路。ANXA1富集于抗原加工提呈、NOD样受体信号通路；ARL4C和NKG7共同参与FoxO信号通路、Rap1信号通路；CD79B与B细胞受体信号通路相关；SLC11A1涉及脂肪细胞因子信号通路和MAPK信号通路。

GSVA分析进一步显示，高表达ANXA1富集于PI3K/AKT/mTOR信号通路，SLC11A1与活性氧（ROS）通路和IL6/JAK/STAT3信号传导相关，这些通路共同构成了牙周炎发病的分子基础。

免疫浸润分析

通过ssGSEA分析29种免疫细胞群的浸润水平，研究发现牙周炎患者中T辅助细胞群显著富集。基因-免疫细胞相关性分析显示，VIM与滤泡T辅助细胞（Tfh）呈负相关，SLC11A1与自然杀伤细胞（NK细胞）正相关、与B淋巴细胞负相关，揭示了不同免疫细胞亚群在牙周炎中的特异性和协同功能。

单细胞数据中关键基因的表达谱

单细胞转录组分析显示，7个枢纽基因在10种免疫细胞亚群中呈现细胞类型特异性分布。ANXA1和NKG7在单核细胞中表达显著上调，表明它们在牙周炎免疫反应中发挥重要作用。与炎症介质IL17和TGF-β（转化生长因子-β）的共表达分析揭示了复杂的细胞因子-基因调控网络。

细胞亚群受体-配体关系分析和关键细胞亚型的发育轨迹

CellChat分析揭示了牙周炎微环境中免疫细胞与其他细胞组分间复杂的相互作用网络。树突状细胞与NK细胞、单核细胞和CD8⁺T淋巴细胞表现出广泛的相互作用，单核细胞与树突状细胞、NK细胞以及T细胞亚群均有密切联系。

伪时间轨迹分析显示了T细胞亚群的分化过程和相关基因表达动态，在发育轨迹的关键分支点发现了显著的转录重编程事件。

研究结论与意义

该研究通过整合单细胞RNA测序和孟德尔随机化方法，首次建立了牙周炎中免疫细胞与枢纽基因间的因果关联。ANXA1和SLC11A1被确定为重要的遗传风险因素，通过调控PI3K-AKT-mTOR信号通路、ROS代谢和IL6-JAK-STAT3信号传导，促进CD8⁺T细胞活化和中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，加剧牙周组织破坏。而CD79B、ARL4C、NKG7、LRRC25和VIM则通过调节B细胞受体信号传导和免疫平衡发挥保护作用。

实验验证通过RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）和免疫组织化学证实了ANXA1和SLC11A1在牙周炎组织中的表达上调，与MR结果一致。这些发现不仅深化了对牙周炎免疫机制的理解，还为开发靶向免疫治疗策略提供了新方向。

研究的创新性在于将多组学数据与因果推断方法相结合，克服了传统观察性研究的局限性，为牙周炎的精准医疗奠定了基础。未来研究应着重阐明这些基因在牙周炎进展中的具体分子机制，评估其作为早期风险分层生物标志物的效用，并探索靶向基因调控策略以增强对牙周病原体的先天免疫反应。