轮胎添加剂6PPD及其衍生物通过氧化应激诱导A549人肺上皮细胞DNA损伤的机制研究

本研究针对环境中广泛存在的轮胎添加剂（如PPDs和BTs）对人体健康的潜在威胁，系统评估了6PPD、6PPD-Q、DPPD、BTZ和MBT对人肺上皮细胞A549的毒性效应。研究发现这些化合物均能浓度依赖性诱导谷胱甘肽（GSH）耗竭和DNA链断裂，而N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）干预可显著缓解6PPD引起的氧化损伤和基因毒性，揭示了氧化应激是其关键作用机制。该研究为评估轮胎添加剂的环境健康风险提供了重要实验依据。

　　

随着汽车工业的快速发展，轮胎磨损产生的颗粒物及添加剂已成为环境污染物的重要来源。其中对苯二胺类（PPDs）抗氧化剂（如6PPD）和苯并噻唑类（BTs）硫化促进剂（如MBT）被广泛应用于轮胎生产，这些化合物及其转化产物（如6PPD-醌）在环境介质和人体样本中频繁检出。然而，目前关于这些化合物对人类健康影响的毒理学研究仍十分有限，特别是其对呼吸系统的潜在危害机制尚不明确。

为填补这一研究空白，由Samuel Hyman领衔的国际研究团队在《Scientific Reports》发表了最新研究成果，系统探讨了5种轮胎添加剂（6PPD、6PPD-Q、DPPD、BTZ和MBT）对人肺上皮细胞A549的毒性效应。研究通过细胞毒性检测（WST-1和LDH法）、活性氧（ROS）生成测定（DCFH-DA法）、谷胱甘肽（GSH）水平检测（ThioGlo-1法）和DNA链断裂评估（彗星实验）等多维度方法，揭示了这些化合物通过氧化应激途径诱导DNA损伤的机制。

关键技术方法包括：1）使用人肺腺癌上皮细胞系（A549）作为体外模型；2）采用WST-1和LDH双重检测法评估细胞代谢活性和膜完整性；3）通过DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；4）利用ThioGlo-1荧光法定量细胞内GSH含量；5）通过碱性彗星实验（comet assay）检测DNA链断裂，并使用γ射线校准曲线将结果转换为每10^9碱基对的损伤数。

研究结果

细胞毒性：24小时暴露实验显示，BTZ可浓度依赖性降低细胞代谢活性（最高浓度使活性降低45%），而DPPD、BTZ和MBT则显著增加培养基中LDH活性（最高分别增加6.5%、18%和18%），表明细胞膜完整性受损。

细胞内ROS生成：3小时暴露实验中，仅6PPD在10μg/mL浓度下引起ROS显著升高，其他添加剂未呈现明显效应。阳性对照H₂O₂使ROS生成增加4.9倍。

谷胱甘肽水平：所有添加剂在3小时和24小时暴露中均引起GSH浓度依赖性耗竭。6PPD作用最为显著，3小时和24小时暴露分别使GSH降低3.6和4.4 nmol/10^6细胞。DEM（二马来酸乙酯）和BSO（丁硫氨酸亚砜胺）阳性对照实验证实了GSH耗竭模型的可靠性。

DNA损伤：彗星实验表明，24小时暴露后，所有添加剂均引起DNA链断裂浓度依赖性增加。6PPD、BTZ和MBT在趋势检验和方差分析中均显示统计学显著性，而6PPD-Q和DPPD仅在一种检验中显显著。

NAC干预效应：添加10 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）显著缓解了6PPD引起的GSH耗竭和DNA损伤，证实氧化应激在该过程中的核心作用。统计分析显示6PPD与NAC之间存在显著交互作用（P<0.01）。

讨论与结论

本研究首次系统评估了多种轮胎添加剂对人肺上皮细胞的综合毒性效应。结果表明，虽然实验浓度高于环境实际水平，但所有测试化合物均能通过氧化应激机制引起GSH耗竭和DNA损伤。6PPD的毒性机制最为明确，其通过ROS生成导致氧化损伤，而NAC的保护效应进一步证实了这一途径。

其他添加剂如6PPD-Q和BTs的机制可能更为复杂，涉及代谢活化产生亲电产物（如醌类代谢物）或受体介导的毒性通路。值得注意的是，国际癌症研究机构（IARC）已将MBT列为2A类致癌物（可能对人类致癌），而流行病学研究提示BTZ暴露与肺癌风险增加相关。

该研究的发现为理解轮胎添加剂的健康风险提供了机制性证据，提示需要关注这些污染物通过吸入、摄入和皮肤接触等多种暴露途径对人群健康的潜在影响。未来研究应聚焦于慢性低剂量暴露效应，并探索这些化合物与其他环境污染物的联合毒性作用。