蝴蝶变态发育的全基因组DNA甲基化与转录组整合分析揭示能量代谢和肌肉发育的关键调控机制

本研究通过整合长读长DNA和RNA测序技术，对蝴蝶（Bicyclus anynana）从幼虫到蛹晚期的五个连续发育阶段进行全生物体分析，揭示了变态过程中代谢和发育转换的分子机制。研究人员发现幼虫期脂质代谢向蛹期肌肉形成和线粒体能量生成的转录重编程，鉴定出545个基因存在差异异构体使用（尤其涉及能量代谢和肌肉神经发育），并证实基因体内CpG甲基化与表达水平正相关但非动态调控主导因素。该研究为昆虫完全变态的表观遗传调控提供了全新见解，对理解生物发育可塑性和进化适应性具有重要意义。

　　

蝴蝶的变态过程是自然界最令人着迷的发育现象之一，毛虫如何蜕变为蝴蝶涉及复杂的形态重建和生理重构。尽管果蝇等模式生物的变态研究已取得进展，但鳞翅目昆虫（包括蝴蝶和蛾类）的分子机制仍未明晰。特别是全生物体水平的表观遗传调控和转录组动态变化缺乏系统研究。英国布莱顿大学和葡萄牙里斯本大学的研究团队在《Scientific Reports》发表了突破性研究，通过对实验室蝴蝶Bicyclus anynana五个关键发育阶段的全生物体多组学分析，揭示了变态过程中代谢转换、组织重建的分子程序及其表观遗传调控特征。

研究人员采用牛津纳米孔长读长测序技术，对同一个体的DNA和RNA进行同步测序。技术方法主要包括：1）对5龄幼虫（L5）、化蛹当天（P0）及化蛹后2天（P2）、4天（P4）、6天（P6）三个生物学重复进行全生物体采样；2）使用纳米孔cDNA测序获得全长转录本；3）直接检测DNA修饰无需化学转化；4）应用espresso、rMATS-long等算法进行差异剪接分析；5）通过modkit和DSS进行甲基化差异区域鉴定。

Metamorphic shifts in transcription required for cellular energy metabolism and myogenesis

转录组分析发现35,085个转录异构体来自11,728个基因位点，包括734个新基因位点。主成分分析显示发育阶段沿PC1轴明显分离，L5与P6分别位于两端，P2处于中间过渡状态。共鉴定4,171个差异表达基因，形成8个共表达簇：幼虫期（L5）高表达基因富集于脂肪酸合成和脂代谢功能，而蛹期（P2-P6）高表达基因显著富集于线粒体能量生成、钙离子信号传导和心肌形成相关通路。蛹晚期还出现体色着色相关酶基因的上调，与成虫色素沉积的生物学过程一致。

Differential isoform use during metamorphosis is prominent in genes for energy metabolism, and for muscle and neural development

约45%基因位点存在多个转录异构体，发现20,000余个新异构体。差异异构体使用分析显示545个基因在发育阶段间存在显著剪接变化，其中55%涉及多个比较组。值得注意的是，差异剪接基因与差异表达基因重叠度很低（仅8.2%），表明转录调控和剪接调控相对独立。关键发现包括：ATP合酶亚基（BIGESP.3953等）、线粒体呼吸链复合物组分（BIGESP.2612等）及糖酵解关键酶（磷酸果糖激酶BIGESP.302、丙酮酸激酶BIGESP.6628）存在阶段特异性异构体转换。肌肉发育基因呈现同步的差异表达和差异剪接：肌钙蛋白T2（BIGESP.3768）和C（BIGESP.2888）在蛹晚期表达达峰且异构体使用模式发生转变；原肌球蛋白1（BIGESP.9197）、肌球蛋白轻链1（BIGESP.5747）和重链（BIGESP.7889）均显示双重调控。神经损伤应答蛋白ninjurin-A（BIGESP.8444）在P2期显著诱导表达，其同源基因ninjurin-1在P4期上调，提示其在神经再生和肌肉发育中的作用。

Gene body methylation is associated with levels of gene expression

DNA甲基化分析显示平均2.95%的CpG位点被检测到甲基化，其中0.4%位点甲基化水平>50%。甲基化位点集中分布于基因内部区域，尤其外显子区（完全缺失于基因间区）。5′端外显子（第2-3外显子）甲基化程度最高，内含子甲基化水平较低且呈不均匀分布。基因平均甲基化水平与表达强度呈显著正相关，但存在两个高度表达基因群体：1,077个基因呈现中高甲基化（10-100%），主要富集于核糖体生物发生、翻译和RNA剪接等看家功能；1,857个基因无甲基化，富集于小分子代谢过程。阶段间差异甲基化区域（DMR）数量稀少（<50个/比较组），且与差异表达/剪接基因重叠度极低（仅8个和4个基因）。5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）修饰水平极低（0.036%位点>10%修饰），未检测到显著差异羟甲基化区域。

研究结论表明蝴蝶变态涉及从幼虫脂代谢到蛹期肌肉和线粒体功能建立的转录重编程，差异剪接在能量代谢和肌肉发育基因调控中发挥重要作用。基因体内CpG甲基化与表达水平相关但非动态调控主因，可能主要维持看家基因的稳定表达。该研究首次提供全生物体水平的蝴蝶变态多组学图谱，为昆虫发育可塑性和表观遗传调控进化提供了重要见解。研究建立的纳米孔长读长测序分析方法为解析复杂转录组和表观基因组提供了新范式，对理解生物形态建成的分子基础具有广泛意义。