芒柄花素通过恢复ALDH2功能并激活ERK1/2–Nrf2抗氧化信号通路缓解酒精性肝病

《Phytomedicine》：Formononetin mitigates alcoholic liver disease by restoring ALDH2 function and inducing ERK1/2–Nrf2 antioxidant signaling

本研究针对酒精性肝病（ALD）中乙醛积累和氧化应激等关键病理问题，研究人员开展了芒柄花素（FN）治疗ALD的主题研究。结果表明，FN通过直接靶向ALDH2增强其酶活性，并激活ALDH2–ERK1/2–AP-1–Nrf2信号轴，显著改善乙醇诱导的肝损伤、纤维化和脂质积累，为天然化合物治疗ALD提供了新策略。

　　

酒精消费已成为全球性的健康问题，近24亿人饮酒，其中9.6亿人为重度饮酒者。世界卫生组织报告显示，每年有近300万人的死亡与酒精使用相关，占全球所有死亡的5.3%，占肝硬化相关死亡的47.9%。酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease, ALD）是长期过量饮酒导致的主要肝脏疾病，其病理特征包括氧化应激、毒性乙醛积累、炎症浸润和纤维化，最终可发展为肝硬化甚至肝细胞癌。

乙醇在肝脏中代谢，90%以上通过酒精 dehydrogenase (ADH) 转化为乙醛，再由线粒体乙醛 dehydrogenase 2 (ALDH2) 氧化为乙酸。然而，慢性或过量饮酒会导致乙醛和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的病理积累，促进脂质过氧化、线粒体损伤、炎症和纤维化，共同推动ALD的发生发展。尽管早期ALD在戒酒后可能部分逆转，但持续酗酒常导致不可逆的肝损伤。目前，ALD的治疗选择有限，迫切需要新的有效干预策略。

ALDH2作为乙醇解毒的关键限速酶，其活性可能因氧化应激或遗传多态性而显著受损。例如，约36%的东亚人群携带ALDH2 * 2 (Glu504Lys) 变异，导致酶活性降低，对酒精诱导的肝损伤易感性增加。此外，ROS和乙醛本身可直接抑制ALDH2功能，进一步加剧肝细胞损伤。因此，恢复ALDH2活性或上调其表达是缓解ALD进展的有前景的治疗策略。

近年来，植物来源的天然化合物因其肝保护特性受到越来越多关注。异黄酮类是一类广泛分布于豆科植物中的植物雌激素，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多种生物活性。其中，芒柄花素（Formononetin, FN）是一种从黄芪、红三叶草和大豆中分离的主要异黄酮，展现出广泛的药理益处。先前研究证实，FN通过多种分子机制改善心血管疾病、肥胖、动脉粥样硬化、神经毒性和高血压。此外，FN还被证明可调节脂质代谢和促进脂肪酸β-氧化，从而缓解非酒精性脂肪性肝炎（NASH）模型中的肝脂肪变性。在之前的工作中，FN还通过调节PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路保护 against 肝缺血/再灌注诱导的线粒体功能障碍。然而，尽管FN具有 demonstrated 的肝保护潜力，其在乙醇诱导的肝损伤中的功效和潜在机制仍 largely 未探索。

本研究旨在调查FN对酒精诱导的肝损伤的保护作用，并在体内（ALD小鼠模型）和体外（乙醇处理的肝细胞）设置中阐明其潜在分子机制。为了阐明潜在分子机制，进行了非靶向代谢组学和转录组学（RNA-seq）分析。使用LiP-MS、SPR、计算建模和CETSA实验来声明FN的直接蛋白靶点。随后使用化学抑制剂和RNA干扰验证了潜在的信号通路和关键蛋白靶点。这项研究为芒柄花素治疗ALD的治疗潜力提供了 novel 见解，特别是通过其调节醛解毒和线粒体稳态的作用，并为开发基于天然化合物的酒精相关肝病干预措施提供了有前景的基础。

为开展研究，作者主要应用了以下关键技术方法：通过慢性酒精灌胃建立小鼠ALD模型并进行FN干预；利用非靶向代谢组学（LC-MS/MS）和RNA测序分析肝组织代谢物和基因表达变化；采用有限蛋白酶解质谱（LiP-MS）、表面等离子共振（SPR）和细胞热转移 assay (CETSA) 鉴定FN的直接蛋白靶点；通过分子对接和分子动力学模拟验证结合相互作用；使用AAV介导的siRNA敲低和药理学抑制剂进行功能验证；通过组织学染色、生化指标检测和免疫荧光等技术评估肝损伤、氧化应激和线粒体功能。

Formononetin administration ameliorated Ethanol-induced liver injury in mice

通过慢性酒精喂养诱导小鼠ALD模型，FN治疗显著减轻了乙醇诱导的肝坏死、炎症浸润和脂质沉积，降低了ALD活性评分。FN剂量依赖性地降低血清ALT、AST、ALP和TBA水平，逆转肝组织和血清中TG、FFAs和胆固醇的升高，减少肝胶原沉积和细胞凋亡。这些发现表明FN能够改善乙醇 consumption 引起的小鼠肝损伤。

Metabolomics analysis of FN against ALD

非靶向代谢组学分析显示，FN显著调节肝组织代谢，主要影响脂质代谢（脂质和类脂分子占20%，脂肪酸占8.53%），并显著调节NAD、2-羟基戊二酸和胍基琥珀酸的产生，表明FN对线粒体代谢有调节作用。通路分析显示FN显著调节NAD代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢，并激活Nrf2抗氧化通路。KEGG分类分析表明氧化磷酸化、酒精性肝病、长寿调节通路和活性氧参与了FN的调节作用。

Formononetin protected against ethanol induced aldehyde toxicity

FN显著降低乙醇诱导的ROS产生，减少4-HNE和TBARS水平，恢复GSH、GSH/GSSG和GPX4水平，表明其对脂质过氧化的抑制作用。FN还恢复线粒体数量（TOM20染色），改善线粒体肿胀和嵴消失，恢复NAD、NAD+/NADH和ATP水平，防止线粒体电子传递链 disruption（线粒体 transmembrane 电位和复合物I活性），并增加mtDNA水平。这些结果表明FN prevented 乙醇代谢物醛诱导的脂质过氧化和线粒体 dysfunction。

Potential mechanism of FN against ALD injury revealed by RNA-Seq analysis

RNA-seq分析显示，FN处理组与模型组之间存在781个上调和1,771个下调的差异表达基因。GO富集分析显示FN显著调节氧化还原、细胞氧化剂解毒、脂肪酸和脂质代谢过程以及线粒体呼吸链复合物I组装等生物过程。KEGG通路富集分析突出显示了氧化磷酸化、 thermogenesis、脂肪酸代谢和花生四烯酸代谢等通路。GSEA基于GO术语显示，与NAD+代谢过程、ROS代谢过程的正向调节和细胞对氧化应激的反应相关的基因集显著富集。Reactome通路富集发现"呼吸电子传递"、"HMOX1表达调节"和"NFE2L2对ROS的感知"等通路显著富集。这些RNA-seq结果共同表明，FN调节脂肪酸代谢、线粒体功能（特别是呼吸复合物I）和氧化应激反应相关基因的表达，且NFE2L2（编码Nrf2蛋白）及其下游靶点的通路富集强烈表明Nrf2介导的抗氧化反应在FN的保护作用中起关键作用。

Restoration of Nrf2 mediated the beneficial effects of FN

qRT-PCR和Western blot分析显示，FN恢复乙醇暴露下调的Nrf2及其下游靶基因（Hmox1、Nqo1、Gclm和Gclc）的mRNA和蛋白表达。免疫荧光染色证实FN处理恢复Nrf2的核定位。AAV介导的siNrf2敲低废除FN的保护作用：逆转FN诱导的线粒体数量恢复（TOM20染色），废除FN对ROS生成和脂质过氧化（DHE和4-HNE染色）的抑制，否定FN介导的TBARS减少，并显著 attenuate FN诱导的GSH水平、GSH/GSSG比率和GPX4水平的增加。这些结果证明FN保护 against 乙醇诱导的氧化应激、脂质过氧化和线粒体损失 critically 依赖于Nrf2信号通路的恢复和激活。

ALDH2 was identified as the direct molecular target of FN

分子对接显示FN与Nrf2直接结合较弱，提示FN通过上游靶点调节Nrf2活性。LiP-MS分析显示FN处理引起ALDH2构象变化，表明直接相互作用。Swiss Target Prediction将ALDH2列为前15位潜在靶点。SPR分析定量确认相互作用，解离常数（K_D）为2.32 μM，显示高亲和力结合。分子 docking 预测强亲和力（-9.46 kcal/mol via Schr?dinger），并通过氢键和疏水接触识别与Phe465、Phe459、Phe296、Phe170和Val120残基的关键相互作用。MD模拟验证结合稳定性，RMSD在平衡阶段约2.4 ?，MM/GBSA计算结合自由能为-52.3433 kcal/mol，表明强结合能力。CETSA实验验证直接结合，FN显著保护ALDH2免于热诱导变性。酶活性测定显示乙醇介导的ALDH2抑制效应被FN挽救，并提高肝组织中乙醛清除活性。这些结果共同确立ALDH2为FN的直接、高亲和力蛋白靶点。

FN increased ALDH2 activity in primary hepatocyte

在原代肝细胞中，FN剂量依赖性地逆转乙醇诱导的细胞毒性， attenuate 乙醇升高的ROS和MDA水平。酶动力学分析显示乙醇 transiently 增加ALDH2活性（30 min），随后显著抑制（60 min）和 near-complete 失活（24 h），FN剂量依赖性地恢复ALDH2活性并防止其乙醇诱导的失活。此外，乙醇下调ALDH2 mRNA和蛋白表达，而FN显著上调ALDH2转录本和蛋白水平。FN显著减少乙醇诱导的4-HNE和乙醛积累， consistent with 其增强解毒作用。这些结果表明FN通过直接增强ALDH2表达和催化活性保护 against 乙醇诱导的肝细胞损伤，从而加速细胞毒性醛类向惰性代谢物的解毒。

ALDH2 Mediated FN-induced activation of the Nrf2 pathway

AAV介导的siAldh2与FN处理相比，显著加剧肝损伤（组织病理学损伤和胶原沉积），逆转FN对ROS和脂质过氧化的抑制，并 attenuate FN诱导的线粒体质量恢复（TOM20染色）。在肝组织中，siAldh2显著降低Nrf2及其下游蛋白（HO-1、GCLM和GCLC）的蛋白表达水平，废除FN对TBARS的降低效应和GSH、GPX4产生的增加效应，并增加醛类产生水平（4-HNE和乙醛）。在原代肝细胞中，siAldh2降低FN增加的Nrf2转录活性，减少Nrf2及其下游靶点（Ho-1、Nqo1、Gclm和Gclc）的基因和蛋白表达水平。这些数据证明FN需要ALDH2来激活Nrf2抗氧化通路并赋予 against 乙醇诱导的肝损伤的保护作用。

ERK1/2-TRE contributes to the regulation effects of FN on Nrf2

乙醇暴露抑制肝磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）水平，而FN显著恢复磷酸化。ERK抑制剂U0126废除FN的保护作用，加剧纤维化、ROS/4-HNE积累和脂质过氧化，而ERK激动剂Ro 67-7476与FN协同，进一步减少过氧化标志物。FN对Nrf2通路的调节作用被U0126抑制，而被Ro 67-7476增强。FN促进磷酸化AP1核转位，被U0126抑制。在原代肝细胞中，FN增加的TRE转录活性和Nrf2基因表达被U0126减少。CHIP-qPCR实验显示FN增强AP1与Nrf2启动子中TRE motif（TGCGTCA）的结合，而U0126抑制此效应。AP1抑制剂SR 11302也抑制Nrf2基因表达和下游蛋白（HO-1、NQO1和GCLM）表达。这些结果表明FN激活ERK1/2以磷酸化AP-1，驱动其与Nrf2启动子中TRE motif的结合并反式激活Nrf2依赖性细胞保护。

研究结论和讨论部分强调，FN通过直接结合ALDH2增强其酶活性，促进乙醛和其他反应性醛类的解毒，同时激活ALDH2–ERK1/2–AP-1–Nrf2信号 cascade，导致Nrf2依赖性抗氧化基因的上调和 redox 稳态的恢复。这项研究首次阐明了FN在ALD中发挥治疗作用的直接分子靶点和下游信号机制，不仅澄清了FN作用的机制基础，而且强调了芒柄花素作为治疗酒精相关肝病的有前景的天然治疗候选物的潜力。ALDH2–Nrf2轴作为FN保护作用的关键介体的 identification 为靶向线粒体解毒和抗氧化通路的ALD治疗策略提供了新的见解。论文发表在《Phytomedicine》期刊。