漆酶Lac-W与ABTS介导系统高效降解伏马毒素B1、B2和B3及其解毒机制研究

本研究针对谷物及食品中常见的伏马毒素B族（FBs）污染问题，构建了漆酶Lac-W与ABTS介导系统（LMS），在优化条件（静态、pH 7.0、40°C）下，24小时内对FB1、FB2和FB3的降解率分别达88.25%、93.16%和78.24%。降解产物对猪肠上皮细胞无毒性，并通过高分辨质谱鉴定出水解FB1（HFB1）和三羧酸两种解毒产物。分子对接揭示了ABTS作为高效电子受体促进Lac-W降解FB1的机制，为食品中FBs的生物酶法净化提供了新策略。

　　

在全球食品安全领域，真菌毒素污染一直是一个棘手的难题。其中，伏马毒素（Fumonisins）作为由镰刀菌等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于玉米、大麦、大豆等谷物及制品中。B族伏马毒素（FBs）是污染最为普遍的类型，主要包括伏马毒素B₁（FB₁）、B₂（FB₂）和B₃（FB₃）。FB₁因其高毒性，已被国际癌症研究机构（IARC）列为2B类可能人类致癌物。在发展中国家，FB₁的暴露水平甚至远超世界卫生组织建议的每日最大耐受摄入量，对婴幼儿健康构成严重威胁。传统的物理和化学去毒方法存在设备要求高、成本昂贵、可能引入二次污染等局限性。微生物吸附法虽有一定效果，但其安全性和效率有待进一步评估。因此，开发高效、安全、特异的生物酶法降解技术成为控制FBs污染的研究热点。

漆酶（Laccase）是一种多铜氧化酶，能够利用分子氧作为共底物，氧化多种酚类及其他底物，反应副产物仅为水，具有环境友好、底物广泛等优点。先前的研究表明，漆酶Lac-W能够在没有介体（mediator）存在的情况下降解多种霉菌毒素，包括黄曲霉毒素B₁（AFB₁）、玉米赤霉烯酮（ZEN）等，但对FB₁的降解率较低（仅18%）。为了提升Lac-W对FBs的降解效率，河南农业大学的研究团队在《Toxicon: X》上发表了他们的最新研究成果，他们通过构建漆酶介体系统（Laccase Mediator System, LMS），显著提高了对FB₁、FB₂和FB₃的降解效率，并深入探究了其解毒效果和作用机制。

为了开展本研究，研究人员运用了几个关键技术方法：首先，通过体外酶促反应体系，系统筛选了15种不同介体（如ABTS、SA、香草醛等）对Lac-W降解FB₁的促进作用。其次，利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）精确量化FBs的降解率。再者，使用猪肠上皮细胞IPEC-J2模型，通过CCK-8法评估了FBs及其降解产物的细胞毒性。此外，采用高分辨质谱（Orbitrap Exploris 120 MS）对FB₁的降解产物进行了结构鉴定。最后，通过同源建模（基于RoseTTAFold，模板为PDB:1GSK）和分子对接（使用Discovery Studio的CDOCKER工具）模拟了Lac-W与ABTS及FB₁的结合模式，以阐明其相互作用的分子机制。研究中使用的污染饲料样本包括酒精糟及其可溶物和玉米浆。

3.1. 降解FB₁

3.1.1. 氧化还原介体促进FB₁的降解

研究人员筛选了15种介体，发现ABTS对Lac-W降解FB₁的促进作用最强，能在2小时内将降解率从无介体时的低水平提升至34.70%。其他如SA、香草醛等也有一定促进作用，而TEMPO则表现出抑制作用。

3.1.2. 优化Lac-W降解FB₁的条件

通过系统优化反应条件，确定最佳降解体系为：静态条件、pH 7.0、温度40°C、Lac-W浓度0.5 U/mL、ABTS浓度5 mM。在此条件下，1 μg/mL的FB₁在2小时内降解率达68.01%，24小时后可达88.25%。研究还发现FB₁在pH 5.0时最稳定，但Lac-W-ABTS系统在pH 7.0时降解效率最高。系统对大多数离子耐受性良好，仅Fe²⁺在高浓度下表现出剂量依赖性的抑制。

3.1.3. Lac-W-ABTS对FB₂和FB₃的降解

在相同优化条件下，Lac-W-ABTS对FB₂和FB₃也表现出高效的降解能力。2小时降解率分别为76.85%和51.83%，24小时后降解率进一步提升至93.16%和78.24%。这表明Lac-W-ABTS能够同时高效降解三种主要的B族伏马毒素。

3.2. 污染饲料中FBs降解效率评估

在实际饲料基质（酒精糟及其可溶物和玉米浆）中，Lac-W-ABTS仍能有效降解FBs，但效率较缓冲体系有所下降。在酒精糟及其可溶物中，FB₁、FB₂和FB₃的降解率分别为72.17%、83.81%和61.76%；在玉米浆中则分别为64.85%、78.53%和57.40%。这种效率的降低可能与基质中成分（如蛋白质、多糖）与酶或毒素的相互作用，以及微生物代谢物影响局部反应环境有关。

3.3. Lac-W-ABTS对FBs解毒作用的评估

细胞毒性实验表明，原始的FB₁、FB₂和FB₃对IPEC-J2细胞的活力具有剂量依赖性的抑制作用。然而，经Lac-W-ABTS降解后的产物，即使在最高测试浓度下，也未表现出细胞毒性，细胞活力与对照组无显著差异。这证明Lac-W-ABTS降解FBs的过程实现了有效的解毒。

3.4. Lac-W-ABTS降解FB₁产物的确定

通过高分辨质谱分析，鉴定出FB₁（C₃₄H₅₉NO₁₅）经Lac-W-ABTS降解后产生两种主要产物。一种产物的分子式为C₆H₈O₆，对应于FB₁分子中的三羧酸基团片段。另一种产物的分子式为C₂₂H₄₇NO₅，其结构与已报道的水解伏马毒素B₁（HFB₁）的核心链一致。这表明降解机制涉及FB₁分子中两个羧酸酯键（C-14和C-15位）的断裂，推测是由ABTS被氧化后形成的自由基（ABTS⁺·）所引发。

3.5. Lac-W与ABTS和FB₁的结合模型

分子对接结果显示，介体ABTS能够结合在Lac-W的催化中心口袋内，其氧原子与Lac-W的G417主链和H419侧链形成氢键，从而有利于电子向T1铜离子（T1 Cu）的转移，形成高活性的ABTS自由基阳离子（ABTS⁺·）。相比之下，由于FB₁分子体积较大，无法直接进入Lac-W的催化中心，其主要结合位点位于催化中心之外。这从分子层面解释了为何ABTS的加入能显著提高Lac-W对FB₁的降解效率：ABTS作为电子穿梭体，扩大了酶的作用范围，使其能够氧化那些因空间位阻而无法直接接触活性中心的底物。

4. 结论

本研究成功构建了漆酶介体系统Lac-W-ABTS，在优化的反应条件下，能够高效、同步地降解三种主要的B族伏马毒素（FB₁、FB₂和FB₃），降解产物对肠道细胞无毒性。通过高分辨质谱鉴定出HFB₁和三羧酸两种解毒产物，揭示了酯键断裂的降解途径。分子对接阐明了ABTS作为高效电子中介，促进Lac-W降解FB₁的分子机制。该研究不仅提供了一种环境友好的生物酶法来解决FBs污染问题，凸显了单一酶制剂同时降解多种结构类似毒素的应用潜力，为开发新型食品及饲料解毒剂奠定了坚实的理论基础和技术支持。