超声空化调控胞内活性氧与基因表达：声动力抗菌治疗新机制

本研究针对细菌耐药性日益严峻的全球健康挑战，创新性地探讨了超声空化在声动力抗菌治疗(aSDT)中的作用机制。研究人员通过系统实验证实：超声联合姜黄素(CUR)可通过机械破坏和活性氧(ROS)介导的双重途径诱导铜绿假单胞菌凋亡；微泡(MBs)增强的空化效应显著提升抗菌效能；RNA-seq分析揭示关键基因(PA4211、PA0876等)的差异表达调控了生物膜重塑和氧化还原平衡。该研究为开发非抗生素抗菌策略提供了重要的分子机制依据。

　　

在全球范围内，细菌感染已成为导致人类死亡的第二大原因，尤其是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌等病原体引发的感染。尽管抗生素长期以来是治疗细菌感染的主要手段，但数十年的滥用导致了日益严重的抗菌素耐药性问题。多重耐药菌株的出现不仅使临床治疗效果大打折扣，甚至让常规手术和器官移植等医疗操作变得风险重重。这一严峻形势促使科学界寻找能够规避传统耐药机制的新型抗菌方法。

在这种背景下，声动力治疗(Sonodynamic Therapy, SDT)作为一种有前景的非抗生素策略应运而生。这种治疗方法利用低强度超声波与声敏剂之间的协同相互作用，与光动力疗法相比具有显著优势：更深的组织穿透深度（可达10厘米）、更好的空间精确性、更低的治疗成本和更小的副作用。然而，尽管大量体外和体内研究已经证明了超声波与声敏剂之间的抗菌协同作用，但其精确的分子机制仍不完全清楚，科学界对此仍存在争议。

近期发表在《Ultrasonics Sonochemistry》的一项研究深入探讨了超声波空化在抗菌声动力治疗(aSDT)中的关键作用。该研究团队选择姜黄素(Curcumin, CUR)作为模型声敏剂，以铜绿假单胞菌为实验菌株，通过综合实验方法系统研究了aSDT的作用机制。

研究人员采用了一系列关键技术方法：通过被动空化检测器(PCD)监测空化强度；使用紫外-可见分光光度计检测CUR产生的活性氧(ROS)；采用血琼脂平板评估抗菌效果；运用流式细胞术测量细胞内ROS产生和细胞凋亡；通过全自动医疗PCR分析系统和实时荧光定量PCR系统检测细胞内基因变化；利用扫描电子显微镜(SEM)观察细菌表面形态变化。所有实验均独立重复三次，确保数据的可靠性。

空化强度对CUR产生ROS的影响

研究结果显示，空化强度与抗菌效果之间存在剂量依赖关系。测试的CUR浓度分别为10、30和50μg/mL，发现空化强度随超声波强度的增加而增加。微泡(MBs)的引入进一步增强了这种空化效应，其中在中间浓度30μg/mL时增强效果最为明显。通过DPBF(1,3-二苯基异苯并呋喃)检测ROS生成发现，随着超声照射时间的延长，吸光度逐渐降低，表明声敏剂在超声刺激下消耗了DPBF并产生了ROS。添加微泡后，ROS产量显著增强，这与空化强度的变化趋势密切相关。

不同浓度声敏剂在有/无微泡条件下的抗菌效果

研究人员通过平板涂布法研究了微泡增强细胞内活性氧生成介导的声动力抗菌效果。实验分为空白对照组、单独超声组、单独CUR组以及不同浓度的CUR与超声联合组。结果表明，超声和CUR单独使用时抗菌能力较弱，但二者结合能显著增强抗菌效果。随着CUR浓度的增加，细菌生长逐渐受到抑制。值得注意的是，添加微泡在所有浓度组中都显著增强了抗菌效果。

通过流式细胞术检测死/活细菌数量

流式细胞术分析显示，在没有微泡的情况下，声敏剂浓度为10、30和50μg/mL时，活菌数分别降至96.8%、92.6%和50.9%。添加微泡后，抗菌效果进一步增强，存活率分别降至95.2%、90.0%和38.2%。这表明空化强度依赖性降低了活细胞计数，证实空化直接诱导细菌死亡而不是仅仅抑制生长。

微泡介导的细胞内ROS产生

研究采用了两种检测方法：先加载DCFH-DA探针后施加外部刺激，以及先进行所有外部刺激后加载DCFH-DA探针。改进后的方法显著增强了荧光信号的稳定性，并大大减小了误差范围。定量分析显示，超声组(93.40%)与对照组(86.20%)相比，细胞内ROS水平有增加趋势，表明超声空化本身有刺激细胞产生少量内源性ROS的潜力。CUR组(99.37%)的ROS水平显著高于对照组，证明CUR分子本身具有强大的ROS生成能力。

通过RNA-seq和qTR-PCR分析细菌基因表达变化

研究发现，在aSDT处理过程中，超声空化效应与声敏剂的协同作用差异性地调控了铜绿假单胞菌中的关键基因：下调PA4211、PA0876和PA3361，上调PA3570、PA2433和PA4880。这些基因表达变化破坏了生物膜结构，抑制其重塑，减少内源性ROS生成，促进细胞外ROS流入。同时，差异表达基因破坏了氧化还原稳态和代谢平衡，可能损害细胞消除过量细胞内ROS的能力，最终导致细胞损伤和细胞内ROS积累增加。

铜绿假单胞菌的形态和结构变化

扫描电镜观察显示，在没有微泡的情况下，随着声敏剂浓度的增加，细菌外膜经历了从完整状态到轻微凹陷，再到更明显变形，最终完全破裂的渐进性结构改变。在微泡辅助条件下，虽然结构降解的总体趋势与无微泡处理一致，但损伤程度明显更严重。在相同CUR浓度下，微泡暴露导致更大的膜变形和更广泛的结构损害。

研究结论表明，aSDT主要通过两种机制发挥抗菌作用：一是空化效应产生的机械作用可以破坏细菌表面结构，导致部分细菌直接死亡；二是虽然超声波单独可以刺激有限的细胞内ROS产生，但主要的杀菌ROS来源于超声波与声敏剂的协同作用。这些协同产生的ROS穿透受损的生物膜，随后诱导细胞凋亡。

从微观角度看，超声空化下调细胞膜形成/重塑和ROS生成的基因，造成不可逆的生物膜损伤，同时抑制内源性ROS产生并促进细胞外ROS流入。此外，它还上调调节细胞内氧化还原稳态和代谢平衡的基因，导致异常的ROS积累。

这项研究的重要意义在于它不仅阐明了声动力抗菌治疗的双重作用机制，还从基因水平揭示了超声空化对细菌细胞过程的深层调控作用，为开发更有效的非抗生素抗菌策略提供了重要的理论基础和实验依据。特别是在当前抗菌素耐药性日益严重的全球健康危机背景下，这种非侵入性、针对性强的治疗方法显示出巨大的临床应用潜力。

该研究通过多技术平台验证了微泡增强声动力治疗的可行性，为空化介导的抗菌治疗提供了新的技术思路，未来可能发展成为针对多重耐药菌感染的有效治疗手段。基因表达分析结果的发现尤为值得关注，因为它不仅解释了声动力治疗的即时抗菌效果，还揭示了其对细菌生理状态的长期影响，这对于理解治疗机制的持久性具有重要意义。