基于免疫信息学的牛结节性皮肤病多表位亚单位疫苗的理性设计

本研究针对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)缺乏高效安全疫苗的现状，利用免疫信息学方法，基于印度LSDV毒株GPCR、P32和RPO30蛋白的保守区域，设计了一种包含16个CTL表位、14个HTL表位和7个B细胞表位的多表位疫苗(MEV)。该590个氨基酸的构建体显示出良好的抗原性、非过敏性和非毒性，分子对接与动力学模拟证实其与牛TLR4受体稳定结合，体外克隆实验表明其可在E. coli中高效表达。该研究为开发针对印度及南亚地区流行毒株的广谱LSDV疫苗奠定了理论基础。

　　

牛结节性皮肤病（Lumpy Skin Disease, LSD）是一种由牛结节性皮肤病病毒（LSDV）引起的烈性传染病，近年来在全球范围内呈现快速传播态势，对畜牧业造成严重经济损失。该病通过吸血昆虫传播，感染牛群可出现高热、皮肤结节、淋巴结炎等症状，虽然死亡率不高，但发病率可高达100%，导致产奶量下降、繁殖效率降低和贸易限制等一系列问题。尤其自2019年以来，LSDV已蔓延至中国、印度、孟加拉国等亚洲多国，成为威胁区域畜牧业安全的重要病原。

目前，市场上虽有同源或异源（如羊痘、山羊痘病毒）的减毒活疫苗可用，但其效果参差不齐，且存在毒力返强、免疫抑制动物中病毒活化等安全风险。更重要的是，目前尚无商品化的LSDV亚单位疫苗。传统的疫苗研发周期长、成本高，难以应对新发突发传染病的快速响应需求。因此，亟需开发一种安全、有效且能提供广泛保护的新型疫苗。

针对这一挑战，研究人员转向了免疫信息学（Immunoinformatics）这一新兴领域。该学科利用计算生物学方法，能够快速、低成本地预测病原体的免疫优势表位，从而理性设计多表位疫苗（Multi-Epitope Vaccine, MEV）。MEV通过组合多个抗原表位，有望同时激发机体的体液免疫和细胞免疫，提供更全面、持久的保护，并且由于其不包含完整的病原体遗传物质，安全性更高。

在这项发表于《Veterinary Vaccine》的研究中，Swati Rani等人报道了他们利用全面的免疫信息学方法，针对LSDV设计的一种新型多表位亚单位疫苗。该研究旨在开发一种能够覆盖印度及南亚地区流行LSDV毒株的广谱疫苗候选物。

为了开展研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，从NCBI数据库获取全球不同地区的LSDV关键蛋白（GPCR、P32、RPO30）序列，通过多序列比对鉴定出保守区域。其次，利用一系列生物信息学工具（如NetMHCpan4.1、NetMHCIIpan-2.1、ABCpred）从这些保守区域中预测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助T淋巴细胞（HTL）和B细胞表位。接着，对预测的表位进行抗原性、过敏性、毒性评估，并筛选出最优表位。然后，使用适当的连接肽和佐剂（β-防御素3）将这些表位组装成多表位疫苗构建体。最后，对该构建体进行了理化性质分析、三级结构预测与优化、与牛Toll样受体4（bTLR4）的分子对接和分子动力学模拟，以及密码子优化和体外克隆可行性分析，以全面评估其作为疫苗候选物的潜力。

3.1. LSDV蛋白共有序列分析

研究人员从NCBI数据库检索了全球不同地区的LSDV的GPCR、P32和RPO30蛋白氨基酸序列（GPCR 21条，P32 8条，RPO30 7条）。通过Clustal Omega进行多序列比对，确定了每个蛋白的高度保守序列区域（长度大于11个氨基酸），这些区域被用于后续的表位预测，为设计具有广谱保护潜力的疫苗奠定了基础。

3.2. 表位筛选

表位筛选是疫苗设计的核心环节。研究团队针对三种蛋白的保守区域，分别预测了CTL、HTL和B细胞表位。

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  CTL表位预测：使用NetMHCpan4.1服务器，针对9个主要的牛白细胞抗原（BoLA）I类等位基因进行预测。最终从GPCR、P32和RPO30蛋白中分别筛选出5、6、4个具有高结合亲和力（百分比排名值低）的CTL表位，例如GPCR蛋白的“TLSDLIFVL”表位与BoLA-T2c和BoLA-T7等位基因强结合。
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  HTL表位预测：使用NetMHCIIpan-2.1服务器，针对5个BoLA-DRB3 II类等位基因进行预测。最终获得了14个强结合表位（GPCR 6个，P32 6个，RPO30 5个）。值得注意的是，P32蛋白的一个表位与所有5个选定的BoLA-DRB3等位基因亚型均能强效结合，显示出引发广泛免疫反应的潜力。所有选定的HTL表位均显示出干扰素诱导潜力。
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  线性B细胞表位预测：使用ABCpred服务器（阈值0.51）进行预测。最终从GPCR、P32和RPO30蛋白中分别筛选出2、3、2个高评分B细胞表位。
  所有筛选出的表位均通过VaxiJen v2.0、Allertop v2.0等工具验证为抗原性强、非过敏性、非毒性，确保了疫苗构建体的安全性。

3.3. 多表位疫苗构建

将筛选出的7个B细胞表位、16个CTL表位和14个HTL表位与β-防御素3佐剂通过特定的连接肽进行组装。佐剂通过EAAAK连接肽连接到N端，随后是B细胞表位（用KK连接肽连接）、CTL表位（用AAY连接肽连接）和HTL表位（用GPGPG连接肽连接）。最终构建的多表位疫苗（MEV-LSDV）由590个氨基酸组成。

3.4. 疫苗安全性预测

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  理化参数分析：使用ProtParam工具分析显示，疫苗构建体的分子量为64.9 kDa，理论等电点（pI）为9.91，表明其呈碱性。不稳定指数为15.59（小于40），表明构建体非常稳定。脂肪族指数为92.63，表明具有较好的热稳定性。总平均亲水性（GRAVY）为0.042，表明具有亲水性。
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  免疫原性评估和溶解度预测：疫苗构建体被预测为抗原性（VaxiJen评分0.66）、非过敏性、非毒性，并且在E. coli中具有较高的可溶性概率（SOLpro评分0.55）。

3.5. 疫苗结构建模、优化与验证

使用trRosetta工具预测了疫苗的三级结构，并通过GalaxyRefine进行优化。优化后的模型（模型4）具有较高的质量：GDT-HA得分0.9623，RMSD得分0.381，MolProbity得分1.084， clashes分数2.9，Ramachandran favored区域达到98.3%。使用ProSA服务器验证，Z得分为-1.03，表明模型质量可靠。

3.6. 构建体与bTLR4的分子对接

由于bTLR4在识别病毒成分和启动免疫反应中起关键作用，研究使用ClusPro服务器将疫苗构建体与通过SWISS-MODEL模拟的bTLR4受体进行分子对接。结果显示，结合能最低的模型（模型1）的结合能为-1178.7，表明疫苗与受体之间存在强烈的相互作用和良好的结合亲和力。

3.7. 分子动力学模拟

为了评估疫苗-bTLR4复合物在接近生理环境下的稳定性，进行了100纳秒的分子动力学模拟。分析根均方偏差（RMSD）、根均方涨落（RMSF）和回转半径（Rg）发现，复合物在模拟后期（约50纳秒后）RMSD趋于稳定，波动较小；RMSF分析显示复合物具有一定的柔性但整体稳定；Rg值也表明复合物结构紧凑。这些结果共同证实了疫苗-bTLR4复合物具有良好的结合稳定性和结构刚性。

3.8. 密码子优化与体外克隆

为了确保疫苗能在E. coli表达系统中高效表达，对疫苗序列进行了密码子优化。优化后的序列密码子适应指数（CAI）为1.0（理想值为0.8-1.0），GC含量为47.29%（理想范围为30%-70%），表明表达效率很高。随后，将优化后的基因序列通过BamHI和MluI限制性内切酶位点克隆到pET28a(+)表达载体中，成功构建了大小为6.218 kb的重组质粒，为后续的重组蛋白表达和纯化奠定了基础。

讨论与结论

本研究成功运用免疫信息学方法，设计了一种针对LSDV的新型多表位疫苗候选物MEV-LSDV。该疫苗基于印度LSDV毒株的关键蛋白（GPCR、P32、RPO30）的保守区域，筛选出了覆盖细胞免疫（CTL、HTL）和体液免疫（B细胞）的多个高抗原性、安全表位。通过合理的连接肽和佐剂（β-防御素3）组装，构建体显示出良好的理化性质、结构稳定性和与牛免疫受体bTLR4的高亲和力结合潜力。分子动力学模拟进一步证实了复合物的稳定性。密码子优化和体外克隆实验表明该疫苗候选物易于在E. coli系统中进行大规模重组表达。

与现有的减毒活疫苗相比，这种多表位亚单位疫苗具有更高的安全性（无病毒复制风险），并可能具备区分感染动物和接种动物（DIVA）的潜力，有利于疫情监测和净化。此外，基于保守区域的设计使其有望对印度及南亚地区流行的LSDV毒株提供广谱保护。

当然，这项研究目前仍处于计算机模拟设计阶段。其真正的效力和安全性需要通过后续的体外实验（如蛋白表达、纯化、免疫细胞激活试验）和体内动物实验（免疫原性、保护效力、安全性评价）来最终验证。尽管如此，该研究为LSDV疫苗的研发提供了重要的理论依据和一个有前景的候选疫苗设计蓝图，展示了免疫信息学在加速新型疫苗开发，特别是应对新发突发动物传染病方面的巨大应用潜力。未来，若该疫苗候选物能通过实验验证，将有望为控制LSD在流行地区的传播、保障畜牧业生产和经济收入做出重要贡献。