超声辅助提取辣木叶黄酮的工艺优化及其抗氧化、抗菌与降糖活性评价

《Applied Food Research》：Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Moringa Leaf Flavonoids and Evaluation of Their Bioactivities

本研究通过响应面法优化了超声辅助提取( UAE )辣木叶总黄酮的工艺，确定了最佳提取条件( 50%乙醇、1:70料液比、61?°C、45?min )，提取率达5.40%。所得黄酮表现出强体外抗氧化活性( ABTS??·清除率98.01%，DPPH·清除率88.91% )，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，并具α-葡萄糖苷酶抑制活性( 49.49% )。LC-MS鉴定出29种黄酮成分。该研究为辣木黄酮作为天然抗氧化剂、抗菌剂和血糖调节剂的功能应用提供了理论支持。

　　

随着人们生活节奏加快和饮食结构变化，高热量食物的过度摄入导致糖尿病、高血糖、高血脂等慢性疾病发病率持续上升，严重威胁公众健康。在此背景下，源自天然植物的活性成分因其多效生理功能而备受关注。辣木（Moringa oleifera）作为一种生长于热带和亚热带地区的植物，其叶片富含蛋白质、多糖、黄酮类等多种生物活性物质，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎等多种功效，在食品和医药领域展现出广阔的应用前景。其中，黄酮类化合物作为辣木叶中的重要活性成分，已被研究证实具有显著的体外抗氧化活性以及降血糖、降血脂作用，成为保健食品和食品加工领域的研究热点。

然而，如何高效、温和地从植物材料中提取这些热敏性活性成分，并保持其生物活性，是天然产物提取领域面临的关键挑战。传统的热溶剂提取法存在提取温度高、时间长、易导致热不稳定成分降解等缺点。相比之下，超声辅助提取（Ultrasound-Assisted Extraction, UAE）技术作为一种温和的物理提取方法，通过超声波产生的空化效应、机械效应等作用，能够有效破坏植物细胞壁，促进细胞内含物的释放，具有操作简便、提取效率高、不易破坏热敏性成分等优势，已被广泛应用于植物活性成分的提取。

为了优化辣木叶总黄酮的提取工艺并系统评价其生物活性，Ji Liu、Yujie Zhi、Ling Liu、Wei Wang和Jian Ren等研究人员在《Applied Food Research》上发表了题为“Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction of Moringa Leaf Flavonoids and Evaluation of Their Bioactivities”的研究论文。该研究旨在通过单因素实验和响应面法（Response Surface Methodology, RSM）系统优化超声辅助提取辣木叶总黄酮的工艺参数，并对提取物的体外抗氧化、抗菌以及α-葡萄糖苷酶抑制活性进行综合评价，同时利用液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, LC-MS）技术鉴定其黄酮组成，为辣木黄酮的功能化应用提供科学依据。

研究人员开展本研究主要运用了几个关键技术方法：首先，他们以市售的干燥辣木叶粉为原料，采用超声辅助提取法，并基于Box-Behnken实验设计，系统考察了乙醇浓度、料液比、超声时间和超声温度四个关键因素对总黄酮得率的影响。其次，他们通过体外化学实验评估了提取物的生物活性：采用ABTS??·和DPPH·自由基清除实验评价抗氧化能力；通过纸片扩散法测定其对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性，并计算最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和抑菌圈直径；采用α-葡萄糖苷酶抑制模型评估其潜在的降血糖活性，并以阿卡波糖（Acarbose）作为阳性对照。此外，研究还利用AB-8大孔树脂对黄酮粗提物进行了纯化，并最终通过LC-MS技术在正负离子模式下对黄酮化合物进行了定性分析。所有实验均设置三次重复，数据以均值±标准差表示，并采用SPSS软件进行方差分析，以评估结果的统计学显著性。

3.1. 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

实验结果表明，总黄酮得率随乙醇体积分数的增加呈先升高后降低的趋势。当乙醇体积分数为50%时，得率达到峰值。这主要是由于大多数黄酮化合物呈弱极性或非极性，遵循“相似相溶”原理，当溶剂极性与之相近时溶解度增大；而当乙醇浓度过高时，极性差异增大反而导致溶解度下降。因此，选择50%乙醇作为响应面优化的中心水平。

3.2. 料液比对总黄酮提取率的影响

总黄酮得率随料液比的增加（即溶剂用量增加）而增加，在1:70（w/v）时达到最大，之后则开始下降。原因可能在于适量的溶剂有利于黄酮溶出和细胞渗透，但过量溶剂可能导致杂质共溶和资源浪费。故确定1:70为最佳料液比。

3.3. 超声时间对辣木叶总黄酮得率的影响

总黄酮得率随超声时间的延长先显著增加，在45分钟时达到最高，之后逐渐下降。短时间提取不充分，而过长时间可能导致黄酮结构降解和杂质溶出增加。因此，优化超声时间为45分钟。

3.4. 超声温度对辣木叶总黄酮得率的影响

得率随超声温度升高呈现先增后减的趋势，在60°C时取得最大值。适当升温可加速溶解，但温度过高可能导致蛋白变性、介质粘度增加，阻碍黄酮释放。最终选取60°C作为中心点。

3.5. 响应面分析

通过Design-Expert软件对实验数据进行回归分析，建立了二次多项式回归模型。方差分析显示模型显著（P < 0.01），决定系数R2为0.8760，拟合良好。各因素对得率影响的主次顺序为：超声温度 > 乙醇浓度 > 料液比 > 超声时间。

3.6. 最佳提取条件的确定与模型验证

软件预测的最优条件为：乙醇浓度50.32%，料液比1:70.07，超声温度61.37°C，超声时间45.13分钟，预测得率5.42%。结合实际操作可行性，将条件修正为：乙醇浓度50%，料液比1:70，温度61°C，时间45分钟。在此条件下进行验证实验，实际平均得率为5.40%，与预测值非常接近，证实模型可靠。

3.7. 辣木叶总黄酮的ABTS??·自由基清除活性

辣木叶总黄酮表现出良好的ABTS??·自由基清除能力，且清除率与浓度呈正相关。在浓度为1.2 mg/mL时，清除率最高达98.01%，效果接近阳性对照抗坏血酸。

3.8. 辣木叶总黄酮的DPPH·自由基清除活性

总黄酮的DPPH·自由基清除能力也随浓度增加而增强，表现出较强的清除效果。在1.2 mg/mL浓度下，清除率达到88.91%。

3.9. 辣木叶总黄酮的抗菌活性

总黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，且对大肠杆菌的抑制效果更强。对两种菌的MIC均为160 mg/mL。在320 mg/mL浓度下，对大肠杆菌的抑菌圈直径达到11.04 ± 0.28 mm（中度敏感），对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在640 mg/mL时最大为16.14 ± 0.22 mm（敏感）。抗菌活性呈现浓度依赖性。

3.10. 辣木叶黄酮的LC-MS分析

通过LC-MS在正负离子模式下从辣木叶总黄酮中鉴定出29种黄酮类化合物，主要包括芦丁（Rutin）、槲皮素（Quercetin）、异荭草素（Isovitexin）、异鼠李素（Isorhamnetin）、芹菜素（Apigenin）、木犀草素（Luteolin）等。

3.11. 辣木叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

辣木叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率随浓度增加而升高，表现出剂量依赖性。在20 mg/mL浓度下，抑制率达到49.49%，虽低于阳性对照阿卡波糖（90.61%），但仍显示出一定的抑制潜力。

本研究成功优化了超声辅助提取辣木叶总黄酮的工艺，获得了较高的提取率，并证实了所提黄酮具有优异的抗氧化、抗菌和一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。这些发现表明辣木叶黄酮是一种具有多功能的天然活性成分，在作为天然抗氧化剂、食品防腐剂以及辅助血糖管理的功能食品原料方面具有巨大的开发潜力。该研究不仅为辣木叶的高值化利用提供了技术支撑，也为开发基于天然产物的健康产品奠定了理论基础。未来的研究可进一步聚焦于单一黄酮化合物的分离纯化、其体内活性的验证以及具体作用机制的深入探索。