仿生骨微环境重建前列腺癌骨转移的增殖抑制与治疗抵抗表型

《Bioactive Materials》：Biomimetic bone niche reconstructs proliferation-inhibited and therapy-resistant bone-metastatic prostate cancer

本研究针对前列腺癌骨转移中增殖抑制性肿瘤细胞缺乏生理相关模型的难题，开发了集成CaP支架、dECM水凝胶、MSCs和成骨细胞的3D仿生骨微环境。该模型成功诱导前列腺癌细胞呈现与患者单细胞转录组特征高度一致的增殖抑制状态，并伴随代谢重编程和恩杂鲁胺耐药，为靶向耐药肿瘤状态的疗法开发提供了临床相关工具。

　　

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，当其发生转移时，骨骼是最常见的“目的地”之一。然而，这些抵达骨骼的肿瘤细胞并非都立即“大张旗鼓”地生长。相反，其中一部分会进入一种“潜伏”状态，其增殖活动受到抑制。这种状态虽然暂时遏制了肿瘤的快速膨胀，却也带来了两大临床难题：一是这些细胞对常规化疗和靶向治疗（如雄激素受体信号通路抑制剂）不敏感，导致治疗抵抗；二是它们如同埋藏在体内的“定时炸弹”，可能在沉寂多年后重新被激活，引起疾病复发。遗憾的是，由于缺乏能够精准模拟人体骨骼复杂微环境的实验模型，科学家们一直难以在实验室里深入观察和研究这群关键且稀少的细胞，阻碍了对相关机制的理解和新疗法的开发。

为了攻克这一瓶颈，发表在《Bioactive Materials》上的一项研究成功构建了一种高度仿生的3D骨微环境模型。研究人员巧妙地整合了磷酸钙（CaP）支架（模拟骨小梁结构）、脱细胞基质（dECM）水凝胶（模拟骨髓软组织）、间充质干细胞（MSCs）和成骨细胞，打造了一个接近生理状态的“人工骨”。令人振奋的是，当将前列腺癌细胞置于这个仿生环境中时，它们竟然再现了在临床患者骨转移病灶中观察到的“增殖抑制”关键特征。这些细胞不仅生长速度减慢，细胞周期停滞在G₀/G₁期，其基因表达谱也与患者来源的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据高度吻合，均显示出细胞周期通路的下调和DNA修复等生存信号的上调。更重要的是，该模型还模拟了临床上的治疗抵抗现象：处于此环境中的肿瘤细胞对恩杂鲁胺（Enzalutamide）的杀伤作用表现出更强的抵抗力。这一平台首次在体外成功重建了前列腺癌骨转移的增殖抑制和耐药表型，为揭秘肿瘤细胞在骨骼中的“潜伏”与“苏醒”机制，以及筛选能根除这些顽固细胞的药物，提供了强大的工具。

本研究综合运用了多项关键技术。在模型构建方面，采用挤出式3D生物打印技术制备具有仿生结构的磷酸钙 cement（CPC）支架，并结合具有温敏凝胶特性的猪皮来源脱细胞细胞外基质（dECM）水凝胶。细胞实验使用了前列腺癌骨转移来源的C4-2B细胞系、小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）和MC3T3-E1-S14成骨前体细胞，并通过慢病毒转导进行荧光标记以便于追踪。在分析层面，研究对公开数据库（GSE143791, GSE176031）中的前列腺癌骨转移和原发灶单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行了深入分析，并对自己构建的模型中的细胞进行了批量RNA测序（RNA-seq）。此外，还利用iTALK算法进行细胞间配体-受体相互作用分析，采用METAFlux进行代谢通量预测，并通过流式细胞术、共聚焦显微镜、体外成骨诱导分化（ALP/ARS染色）以及小鼠皮下移植模型等多种技术手段对模型的特性和细胞表型进行了全面验证。

2. 结果

2.1. 单细胞数据揭示骨转移性前列腺癌中存在增殖停滞细胞亚群

通过对9例前列腺癌脊柱转移患者和11例前列腺癌根治术患者来源的单细胞RNA测序数据进行分析，研究人员在骨转移病灶，特别是远离肿瘤实质的远端骨髓（Distal site）中，发现了一群独特的肿瘤细胞。与原发性肿瘤细胞或转移瘤实质中的肿瘤细胞相比，这群远端细胞的转录组特征显示，与细胞周期、DNA复制、G₂/M期检查点和有丝分裂纺锤体相关的通路显著下调，而DNA修复等信号则被激活，提示其处于一种增殖受抑制的状态。进一步的细胞间通讯分析预测，间充质干细胞（MSCs）和成骨细胞可能通过胶原-整合素（Collagen-ITGB1）等信号通路与这些增殖抑制的肿瘤细胞相互作用。

2.2. 仿生3D骨微环境的构建

为了在体外模拟这一复杂的体内环境，研究团队通过3D生物打印技术构建了一个复合模型。该模型的核心包括两部分：一是模拟骨小梁力学性能和拓扑结构的3D打印磷酸钙（CPC）支架，其杨氏模量达到~20-30 MPa；二是模拟骨髓软组织的dECM水凝胶，其主要成分为I型胶原，杨氏模量约为100 Pa，与实测的骨髓刚度（500-1200 Pa）相近。该水凝胶具有良好的温敏凝胶特性、剪切稀薄行为和生物降解性，为细胞提供了适宜的三维生长环境。

2.3. 工程化骨微环境的生物相容性与成骨诱导特性

将前列腺癌细胞（C4-2B）、MSCs和成骨细胞（MC3T3）分别或共培养于该仿生骨微环境中，细胞均表现出高活力和良好的伸展形态，证明了模型的生物相容性。特别是成骨细胞能够选择性地附着在CPC支架表面，模拟其在体骨小梁上的分布。当在成骨诱导培养基中培养时，MSCs在模型内表现出强烈的碱性磷酸酶（ALP）活性和钙结节形成（Alizarin Red S染色），成骨相关基因（如Alpl, Bglap, Runx2等）表达显著上调。将构建体植入小鼠皮下4周后，组织学分析显示有大量的细胞外基质沉积和胶原成熟，并检测到成骨标志物osterix（OSX）的表达，证实了其良好的体内成骨能力。

2.4. 重现骨微环境介导的前列腺癌增殖抑制

将C4-2B肿瘤细胞球与MSCs、成骨细胞共培养于仿生骨微环境后，与单纯3D培养的对照组相比，肿瘤球的体积扩张被显著抑制。流式细胞术分析显示，仿生骨微环境中的肿瘤细胞停滞在G₀/G₁期的比例显著增加（76.8% vs 52.7%），而S期细胞比例下降（13% vs 30.9%）。这种抑制效应具有细胞类型特异性，因为更具侵袭性的PC-3细胞在同一环境中则快速增殖，排除了营养竞争等非特异性因素。在小鼠皮下移植瘤实验中，仿生骨微环境组的肿瘤体积和重量也显著小于对照组，且肿瘤细胞增殖标志物Ki-67的表达降低，进一步在体内验证了该模型的抑瘤效果。

2.5. 3D打印模型的转录组谱重现了人骨转移中的前列腺癌增殖抑制表型

对仿生骨微环境和对照组中的肿瘤细胞进行批量RNA测序分析发现，两者具有截然不同的基因表达谱。仿生骨微环境中的肿瘤细胞表现出大量增殖相关基因（如FN1, KIF14, NAMPT等）的下调。基因集富集分析（GSEA）证实，与有丝分裂、染色体分离、纺锤体组装等相关的通路被显著抑制，而p53信号通路和DNA修复通路则被激活。尤为关键的是，将模型细胞的转录组数据与临床患者骨转移单细胞数据进行比较，发现二者在Hallmark通路的改变上存在高度重叠（13个中有9个一致），例如G₂/M检查点和有丝分裂纺锤体通路均下调。双向的单样本GSEA（ssGSEA）分析也强有力地表明，模型成功复刻了临床增殖抑制细胞的分子特征。

2.6. 骨微环境诱导前列腺癌细胞增殖抑制的潜在机制

通过整合差异表达基因、通路富集和代谢通量分析，研究提出了骨微环境诱导增殖抑制的四个协同作用机制：1）氧化应激与即时早期反应：通过上调ROMO1等基因增强ROS清除和DNA修复，以生存为代价换取增殖停滞；2）MAPK与生长信号负调控：通过下调TAOK1等基因削弱MAPK/ERK等促增殖信号；3）线粒体与代谢重编程：代谢偏好从糖酵解转向氧化磷酸化（OXPHOS），降低生物合成需求；4）前列腺分化与抑制：通过上调APOD等基因促进分化状态，抑制去分化和侵袭性。这些机制共同将肿瘤细胞“锁定”在一种增殖缓慢但生存能力强的状态。

2.7. 3D打印骨微环境中的细胞相互作用与耐药性

细胞间相互作用分析预测，MSCs和成骨细胞通过高表达胶原（COL1A2, COL5A1等）与肿瘤细胞上的整合素β1（ITGB1）结合，以及HSP90B1-ERBB2、APP-SLC45A3等配体-受体对，与肿瘤细胞进行通讯，这些相互作用在患者单细胞数据中也得到验证。在功能上，仿生骨微环境中的肿瘤细胞对恩杂鲁胺表现出更强的抵抗力，其存活率更高，凋亡和死亡细胞比例更低。转录组分析提示，MYC靶标和脂肪酸代谢等与恩杂鲁胺耐药相关的通路被激活。利用模型特征基因对TCGA数据库进行分析，显示高表达这些基因的患者其无进展生存期有缩短的趋势，提示该模型具有临床相关性。

3. 讨论与结论

本研究成功开发了一个高度仿生的3D骨微环境模型，该模型首次在体外从转录组和表型两个层面，忠实地重现了临床前列腺癌骨转移中存在的增殖抑制和治疗抵抗特性。该平台不仅证实了骨微环境在主动调控肿瘤细胞命运中的核心作用，还深入揭示了其通过整合氧化应激适应、信号通路抑制、代谢重编程和促进分化等多重机制，诱导肿瘤细胞进入一种类似“持久耐药”的状态。这一模型的建立，克服了传统2D培养和动物模型在模拟人体骨转移微环境复杂性方面的局限，为深入研究肿瘤休眠、耐药机制以及转移复发的分子开关提供了一个强大且可控的体外工具。更重要的是，它为新药研发，特别是针对如何清除这些“潜伏”的、耐药的肿瘤细胞库，以预防转移复发，开辟了新的途径，具有重要的转化医学价值。