综述：基于扩散的表面等离子体共振技术分析生物分子混合物及其在眼科液体模型中的应用进展

《Biosensors and Bioelectronics》：Advances in Flexible High-Density Microelectrode Arrays for Brain-Computer Interfaces

本综述系统介绍了扩散基表面等离子体共振（D-SPR）这一新兴无标记技术，该技术结合了精确的SPR扩散测量与随机计算模拟（如Gillespie算法），能够有效解析二元（如BSA/甘氨酸）和三元（如HSA/泛素/甘氨酸）生物分子混合物的独特扩散模式，无需依赖外部荧光标记或色谱分离。作为概念验证，作者应用该工作流程探测了由轻度酸化（pH 6.5）诱导的牛晶状体α-晶状体蛋白的寡聚态转变，揭示了常规动态光散射（DLS）无法检测到的亚基解离事件。鉴于扩散过程在眼健康中的关键作用，D-SPR方法为医学研究（尤其是眼科学）提供了一种先进且通用的分析工具，具有显著的应用潜力。

　　

生物分子混合物分析的新前沿：D-SPR技术

在生物医学研究、生物化学、组学科学和药物开发领域，表征复杂的生物分子混合物是一项基础性挑战。这对于理解疾病的分子通路、阐明关键分子机制以及制定新的治疗计划至关重要。在众多具有研究价值的生物体液中，眼液是一个信息丰富且具有重要临床意义的目标。对其精密的监测对于眼睛——人体最关键和最复杂的感官器官——的健康至关重要。

D-SPR技术的原理与优势

传统的分析技术，如尺寸排阻色谱（SEC）、反相色谱（RPC）和离子交换色谱（IEC），虽然能提供高分辨率的结果，但可能存在超分子复合物解聚、蛋白质变性或样品损失等问题。质谱（MS）技术具有高灵敏度，但其分辨率对于超过30 kDa的物种和复杂混合物会下降。核磁共振（NMR）波谱学是研究扩散过程的有力工具，但需要复杂昂贵的仪器、氘代溶剂或同位素标记分子，远离生理条件。

为了克服现有技术的局限性，研究者们提出了扩散基表面等离子体共振（D-SPR）技术。D-SPR是一种尖端的分析技术，它利用SPR的光学特性来分析溶液中分子（尤其是生物分子）的扩散特性。该方法能够精确测定物质在微流体环境中的表观扩散系数（D），揭示被分析物种的分子构象和寡聚状态的有价值信息。其核心优势在于无标记、实时检测，并能在接近生理条件下对混合物进行分析。

随机模拟揭示混合物扩散行为

该技术的理论基础是微流体通道中分子扩散和传输的扩散-平流方程，可以通过随机方法（如Gillespie算法）进行数值求解。模拟在一个简化的二维域中进行，其中纵向坐标X(t)代表沿通道轴线的运动，而Y(t)描述横截面内的径向位置。局地对流速度沿X方向是Y的抛物线函数，符合哈根-泊肃叶层流 regime 中速度剖面的经典解。

模拟清晰地表明，具有不同D值的分子沿通道形成不同的界面：高D值的化合物（如小分子甘氨酸，D约为1×10^-9 m²/s）表现出紧凑且近乎高斯的浓度分布，而较大的分子（如人血清 albumin，HSA，D约为6×10^-11 m²/s）则显示出更宽且不对称的分布。差分扩散导致两种分子种群前沿的逐渐分离。模拟的SPR信号轨迹表明，混合物存在下获得的SPR信号是物种间差分到达时间复杂卷积的结果，这为研究生理状态下复杂混合物提供了有价值的信息。

数学模型与实验验证

研究者开发了一个数学拟合模型，将多组分混合物的总一阶导数SPR信号描述为其个体贡献的总和。该模型假设组分之间没有相互作用，并且运行缓冲液与样品之间没有粘度差异。总信号在浓度和折射率增量上都是线性的，并且每个贡献的形状取决于其扩散系数D、温度和流速。

实验上，研究者构建了模拟眼液模型的生物分子混合物系统。第一个二元生物分子系统示例是BSA/甘氨酸混合溶液。原始的SPR信号显示，从100% BSA溶液到100%甘氨酸溶液，斜率逐渐增加，这反映在一阶导数信号中：甘氨酸的信号更窄、更尖锐，而BSA的信号更宽、有偏斜。混合信号由两种储备溶液的贡献组成，中心峰来自甘氨酸，更宽的侧翼头部和尾部来自BSA，这与模拟和数学模型预测一致。

该方法进一步扩展到三元系统，包含等重量/体积百分比的人血清 albumin（HSA）、泛素和甘氨酸。结果表明，只要它们之间没有相互作用，混合物的总一阶导数信号确实由其单个组分的算术和给出。

探测病理刺激下的蛋白质寡聚态转变：以α-晶状体蛋白为例

α-晶状体蛋白是脊椎动物眼晶状体中主要的sHSP和关键分子伴侣，通过防止其他结构蛋白的聚集，在维持晶状体透明度方面起着关键作用。它由两个同源亚基αA和αB组成，组装成大的、异质的寡聚复合物。周围环境的pH值对α-晶状体蛋白的结构、寡聚稳定性及其伴侣活性具有关键影响。

应用D-SPR方法，研究者评估了在酸性pH下α-晶状体蛋白的结构和寡聚稳定性，以模拟病理性的酸中毒条件。在生理条件（pH 7.4）下，α-晶状体蛋白的扩散曲线呈现出明显的双峰特征。在酸性条件下（pH 6.5），扩散曲线分析揭示了显著差异：出现了一个额外的中心峰，指示了一个具有更高D值的种群，同时较低扩散性物种对应的峰有适度展宽。

计算显示，pH 7.4下的全局D值为2.10×10^-11 m²/s，而pH 6.5下为2.82×10^-11 m²/s。转换为平均流体动力学半径后，pH 7.4和pH 6.5下的值分别为11.70 nm和8.71 nm。D-SPR观察到的D值增加趋势表明存在整体流体动力学半径的减小，这与DLS数据似乎存在差异。这种差异源于两种技术检测原理的根本不同：D-SPR整合了溶液中所有物种（包括小寡聚物或解离亚基）的贡献，而DLS严重偏向于散射更强的大分子，有效地掩盖了小组分的存在。因此，D-SPR对寡聚体解离早期事件更为敏感。

在轻度酸性条件下（pH 6.5）观察到的这种结构重组可能表明了对病理刺激的快速响应，这种寡聚化转变可能与眼组织内的疾病状态相关，例如白内障或类似年龄相关性或退行性眼疾的发展机制。

结论与展望

D-SPR方法为在生物相关条件下表征生物分子混合物的扩散模式提供了一种稳健、无标记的途径。通过将精确的扩散测量与随机计算建模相结合，该方法有效克服了在不破坏天然分子状态或不依赖标记和色谱分离的情况下解析和表征混合物的挑战。未来在定量能力方面的增强、对更复杂生物系统的应用、光学设计的实施（如近导波或超长程SPR以扩展探测深度）以及与互补分析方法的集成，将进一步增加D-SPR的影响力，推动生物医学研究、临床诊断和治疗开发的新发现。