综述：探索碳水化合物生物加工中4-α-葡糖基转移酶的酶学景观

《Biotechnology Notes》：Exploring the enzymatic landscape of 4-α-glucosyltransferases in carbohydrate bioprocessing

本综述系统阐述了4-α-葡糖基转移酶（4αGTs）在碳水化合物生物加工领域的酶学景观，涵盖了其分类（GH13/GH57/GH77）、四种核心反应（歧化、环化、偶联、水解）、结构功能关系、理性工程策略及其在改性淀粉、大环糊精（LR-CDs）和糖缀合物合成中的前沿应用，展现了该酶家族在可持续生物制造中的巨大潜力。

　　

引言

碳水化合物活性酶（CAZymes）是生物技术中用于寡糖、多糖和糖缀合物降解与合成的重要工具。其中，4-α-葡糖基转移酶（4αGTs，EC 2.4.1.25），也称为淀粉麦芽糖酶（微生物中）或歧化酶（植物中），在微生物、植物和动物的淀粉和糖原代谢中催化α-1,4-葡聚糖和麦芽寡糖的转移反应。这篇综述旨在全面描绘4αGTs在可持续生物制造领域的巨大潜力。

4αGTs的分类、结构域架构和晶体结构

根据序列相似性，4αGTs在CAZy数据库中被归类为糖苷水解酶家族GH13、GH57和GH77。它们在进化上截然不同，在结构和催化特征上存在根本差异。GH13和GH77与GH70共同构成GH-H clan，共享(β/α)₈-桶状催化域（CD）折叠和天冬氨酸（亲核体）、谷氨酸（质子供体）、天冬氨酸（过渡态稳定剂）这三个保守的催化残基。相比之下，GH57酶具有(β/α)₇-桶状折叠（CD）和天冬氨酸、谷氨酸催化残基对。

目前已解析了多个4αGTs的晶体结构。GH13 4αGTs，如来自Thermotoga maritima和Lactobacillus acidophilus的酶，具有核心的(β/α)₈-桶状结构域A，以及插入的结构域B和C末端结构域C。某些酶还含有N末端结构域（N）或额外的B′结构域。GH57 4αGTs，如Thermococcus litoralis的酶，则包含具有(β/α)??折叠CD的结构域I和扭曲的β-三明治折叠C末端结构域II。GH77 4αGTs根据结构域架构可分为A、B、C、D四组，所有成员都包含A、B1、B2、B3核心结构域。GH77 4αGTs具有三个高度保守的功能性环区：“250s环”、“370s环”和“460s环”，这些环在底物结合、环化反应以及大环糊精（LR-CD）的形成中起着至关重要的作用。

4αGTs的生化特性

4αGTs通过四种类型的反应展现出对淀粉（α-葡聚糖）和麦芽寡糖（MOS）修饰的显著多样性：歧化、环化、偶联和水解。歧化是关键反应，涉及供体底物的切割和片段（DP > 2的MOS）通过α-1,4-糖苷键与受体的非还原末端连接。在淀粉中，4αGTs通过从直链淀粉转移片段来延伸支链淀粉的分支链。环化是另一个重要的反应，通过分子内转糖基化反应生成大环糊精（LR-CDs），也称为环糊精（CAs），其DP范围通常从16到数百。偶联是环化的逆反应，其中环状供体的葡聚糖链被转移到线性受体分子上。水解是次要活性，将葡聚糖中的α-1,4-键断裂成更短的MOS。

在自然界中，4αGTs在碳水化合物的利用中至关重要。GH13 4αGTs参与细菌中的MOS分解代谢以及真核生物中的糖原代谢。GH57 4αGTs参与超嗜热古菌中独特的葡聚糖加工途径。GH77 4αGTs对于细菌中的麦芽糖利用和植物中的淀粉代谢非常重要。

4αGTs的酶工程

为了提高4αGTs的活性、特异性、反应类型和热稳定性，已经尝试了不同的分子修饰策略。合理的蛋白质工程主要围绕提高转糖基化/水解（T/H）比率展开，策略包括：限制水分子进入活性位点、优化受体结合亚位点、削弱催化质子供体的功能以及重塑活性位点入口/通道的几何形状。例如，对GH77 4αGTs中250s环的工程改造可以使其构象更封闭，从而抑制水分子进入并促进转糖基化。对370s环的突变可以调节LR-CD的尺寸分布。

除了定点突变，与淀粉结合结构域（SBDs）（如CBM20）的融合也被用于改变酶对不溶性或聚合底物（如生淀粉颗粒）的亲和力。将SBD融合到Thermoproteus uzoniensis 4αGT（TuαGT）的N末端，显著提高了其对淀粉颗粒的亲和力。未来的工程策略可能会结合定点突变和结构域融合，以创建具有改进的转糖基化活性和增强底物结合能力的超级生物催化剂。

4αGTs的应用

环化反应生成大环糊精（LR-CDs）

4αGTs催化从淀粉相关α-葡聚糖合成大环糊精（LR-CDs）。LR-CD的产量和尺寸分布取决于所使用的4αGT（野生型/突变体）、底物、反应条件（时间、温度、pH）以及有机溶剂的添加。LR-CDs具有亲水性的外表面和疏水性的空腔，能够包合客体分子，从而显著提高难溶性药物（如多潘立酮）、维生素E乙酸酯等的溶解度和稳定性。它们还被探索作为人工分子伴侣辅助蛋白质复性，并作为核酸纳米载体用于基因递送系统。此外，LR-CDs可用于降低淀粉粘度、抑制淀粉回生和改变淀粉凝胶的流变行为。

歧化反应生成改性淀粉

4αGTs修饰的淀粉在食品工业中具有重要应用，因为它们能赋予改进的凝胶特性、消化性、封装能力和各种生物功能。通常，经4αGT处理的糊化淀粉其短分支链（DP < ~10）和长分支链（DP > ~20）含量增加，中长链（DP ~10 – ~20）含量减少。这类改性淀粉最显著的特性之一是能够形成热可逆凝胶，例如由Avebe公司商业化的Etenia?产品，可作为清洁标签的脂肪替代品。此外，4αGT改性淀粉通常表现出对消化酶的抗性增强、凝胶强度提高、冻融稳定性改善以及封装能力增强（如用于包封姜黄素）。将4αGT与其他酶（如分支酶BE）结合使用，可以进一步多样化淀粉的功能性，例如产生具有抗肿瘤和巨噬细胞刺激活性的生物糖原类似物。

糖缀合物和新型寡糖衍生物的合成

4αGTs已被用于催化合成各种生物活性化合物的α-葡聚糖型糖缀合物，以提高其溶解度、生物活性和稳定性。例如，以可溶性淀粉为供体，染料木苷为受体，合成了糖基化染料木苷，其溶解度比染料木苷本身提高了高达4400倍。其他例子包括合成具有增强抗凝血和抗炎活性的糖基化木糖、保留益生元特性但甜度降低的帕拉金糖衍生物、以及溶解度提高且具有抗龋齿潜力的糖基化赤藓糖醇等。这些糖缀合物和新型寡糖在食品、医药和化妆品领域显示出良好的应用前景。

结论与展望

4αGTs是一类具有多种催化活性和广泛应用潜力的酶。对它们进行分类、结构解析、生化表征和工程改造，有助于开发出更高效、更特异的生物催化剂。未来，通过结合人工智能辅助的蛋白质设计、超高通量筛选技术和自动化基因合成等前沿技术，有望加速4αGTs的优化进程，从而推动其在可持续生物制造，特别是在基于淀粉的高附加值产品开发中发挥更大的作用。克服大规模生产LR-CDs的经济性挑战，以及开发高效的下游纯化策略，将是实现其工业化应用的关键。