用于水杨酸快速检测的侧向流免疫层析试纸条开发及其在血浆中毒素筛查中的应用

《Chinese Journal of Analytical Chemistry》：Development of lateral flow immunoassay strip for salicylic acid detection in human plasma

本研究针对水杨酸(SA)传统检测方法操作复杂、耗时长、依赖大型仪器等问题，开发了一种基于金纳米颗粒(AuNPs)标记单克隆抗体的侧向流免疫分析(LFIA)试纸条。该试纸条可实现SA的快速半定量检测，视觉检测限为50 ng/mL， cutoff值为1000 ng/mL，与ic-ELISA方法结果一致，为急诊科和基层医疗机构提供了简便、高效的SA中毒现场筛查工具。

　　

水杨酸(Salicylic Acid, SA)作为阿司匹林的主要活性代谢物，在临床上广泛应用于解热、镇痛、抗炎和抗血小板治疗。然而，SA具有狭窄的治疗窗口，过量使用可能导致中毒，增加机体代谢负担，甚至危及生命。在急诊科对疑似阿司匹林过量患者的诊断和管理中，快速准确测量血液中SA浓度至关重要，这不仅是及时确认中毒诊断和评估严重程度的关键，也是指导针对性治疗（如尿液碱化、血液净化）的重要依据。

目前SA的检测方法主要包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法和电化学分析法等传统技术。虽然这些方法具有较高的灵敏度和准确性，但通常需要昂贵的仪器设备、复杂的样品前处理过程、专业技术人员操作以及较长的检测周期（通常需要数小时甚至更长时间），难以满足临床环境，特别是急诊科、基层医疗机构或现场快速筛查对时效性的迫切需求。

针对这一技术瓶颈，苏州大学附属第二医院的研究团队在《Chinese Journal of Analytical Chemistry》上发表了一项创新性研究，开发了一种用于SA快速检测的侧向流免疫分析(Lateral Flow Immunoassay, LFIA)试纸条。该研究通过制备高特异性的单克隆抗体，建立了基于金纳米颗粒标记的免疫层析检测系统，为SA的现场快速筛查提供了新的技术手段。

研究人员采用了几项关键技术方法开展本研究。首先基于SA的分子结构特征，选择5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid, 5-ASA)作为半抗原，通过戊二醛法将其与载体蛋白（牛血清白蛋白BSA）偶联制备免疫原。利用杂交瘤技术制备了针对SA的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)，并对其亚型、亲和力、特异性和灵敏度进行了系统表征。在此基础上，采用经典的柠檬酸钠还原法合成金纳米颗粒(gold nanoparticles, AuNPs)，并通过pH优化实现了抗体的高效标记。最后，通过系统优化检测线(T线)抗原浓度、抗体标记量以及样品缓冲液中表面活性剂类型等关键参数，建立了性能稳定的LFIA检测体系。研究使用了来自江南大学附属医院提供的人血浆样本进行方法验证。

3.1. 抗原表征

研究人员通过紫外-可见(UV-Vis)光谱扫描证实了免疫原和包被抗原的成功制备。结果显示，BSA和卵清蛋白(OVA)在270 nm处出现特征吸收峰，而半抗原在370 nm处有特征吸收峰。成功制备的免疫原和包被抗原在350 nm附近出现新的紫外吸收峰，这是半抗原与包被抗原形成的偶联产物的特征峰，表明免疫原和包被抗原已成功合成。

3.2. 单克隆抗体表征

通过间接竞争酶联免疫吸附测定(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, ic-ELISA)筛选获得了一株分泌抗SA抗体的杂交瘤细胞系。抗体亚型鉴定显示为重链IgG1和轻链Kappa，亲和常数(Ka)为2.73×10⁹ L/mol。特异性实验表明，该抗体与SA结构类似物的交叉反应性均小于0.01%。通过竞争抑制曲线确定抗体对SA的IC₅₀为198.59 ng/mL。

3.3. LFIA试纸条优化

透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)和UV-Vis光谱表征显示合成的AuNPs粒径分布均匀，具有典型的表面等离子体共振吸收峰。通过组合优化实验确定最佳T线浓度为0.2 mg/mL，抗体标记量为5 μg。在样品缓冲液优化中，发现含有5% BSA的缓冲液能提供最佳的检测性能。在优化条件下，试纸条对SA的视觉检测限(visual limit of detection, vLOD)为50 ng/mL，cutoff值为1000 ng/mL，计算检测限(calculated limit of detection, cLOD)为11.85 ng/mL。

3.4. 基质效应分析

在人血浆基质中，试纸条对SA的vLOD为100 ng/mL，cutoff值为5000 ng/mL，cLOD为34.78 ng/mL。结果表明，本研究开发的LFIA试纸条可有效用于人血浆中SA的定量检测。

3.5. 试纸条稳定性分析

通过加标回收实验验证了试纸条的准确性和稳定性。在100、200和500 ng/mL三个加标水平下，LFIA试纸条的回收率为99.14%-99.72%，变异系数(coefficient of variation, CV)为6.89%-8.70%，与ic-ELISA方法结果高度一致。

3.6. 方法比较

与其他SA检测方法相比，LFIA试纸条具有操作简单、成本低、检测快速、通量高等优势，更适合于现场快速检测和多场景应用。

本研究成功利用5-ASA作为免疫半抗原，通过细胞融合技术制备了抗SA的单克隆抗体，并在此基础上建立了AuNPs标记的LFIA试纸条检测方法。通过系统优化关键参数，建立了一种稳健的人血浆中SA检测方法。该试纸条可实现定性和定量分析，具有低成本、快速检测、样品前处理简单等优点，满足了快速筛查的需求，为SA的临床检测提供了可靠的技术工具。

这项研究的创新之处在于首次将侧向流免疫分析技术应用于水杨酸的快速检测，解决了传统方法在急诊和基层医疗场景下应用受限的问题。该方法不仅为SA中毒的及时诊断和治疗提供了技术支撑，也为其他小分子药物的快速检测提供了可借鉴的技术路线。特别是在当前医疗资源分布不均的背景下，这种简便、快速的检测技术具有重要的临床应用价值和推广前景。