基于二酮吡咯并吡咯-马来酰亚胺的新型荧光探针：高灵敏度检测生物硫醇的创新策略

本研究针对生物硫醇（如Cys、Hcy、GSH）检测中存在的选择性、灵敏度及响应速度等挑战，开发了一系列基于DPP核心的新型马来酰亚胺荧光探针。研究结果表明，探针8对Cys的检测限低至18 nM，响应时间仅5分钟，且具有显著的斯托克斯位移（~70 nm）和良好的选择性，为相关疾病的早期诊断提供了高效工具。

　　

在生命体内，生物硫醇（Biothiols）如半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）扮演着至关重要的角色，它们是维持细胞氧化还原平衡、代谢调控和信号传导的关键分子。然而，这些硫醇浓度的异常波动往往与一系列严重的健康问题密切相关。例如，半胱氨酸水平过低可能导致儿童发育迟缓、肝功能障碍，而过高则与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病相关联。谷胱甘肽作为氧化应激的主要调节者，其耗竭见于神经退行性疾病，而在癌症中则常观察到其水平升高。同型半胱氨酸过量则与神经退行性疾病、骨质疏松和动脉粥样硬化等多种病理状况有关。因此，精准、快速地监测生物体液中这些硫醇的浓度，对于相关疾病的早期发现和诊断具有极其重要的价值。

目前，荧光探针技术因其高灵敏度、快速响应和操作简便等优点，已成为检测生物硫醇的主流方法之一。常见的检测策略包括迈克尔加成（Michael addition）、环化反应、亲核取代和二硫键交换等。其中，马来酰亚胺（Maleimide）基团因其能够通过光诱导电子转移（PET）效应高效淬灭荧光，并在与硫醇发生迈克尔加成反应后生成琥珀酰亚胺，从而解除淬灭、产生显著的“荧光开启”（turn-on）效应，而备受关注。然而，现有的荧光探针仍面临一些挑战，例如对特定硫醇的选择性不足、斯托克斯位移（Stokes shift）较小（导致激发光与发射光容易相互干扰）、量子产率不高、光漂白（Photobleaching）现象以及合成步骤繁琐、产率较低等。

二酮吡咯并吡咯（Diketopyrrolopyrrole, DPP）是一类具有优异光稳定性和热稳定性的染料分子，其光物理性质易于调控，并通常具有较大的斯托克斯位移，因此被广泛应用于有机电子学、医学和荧光探针等领域。尽管DPP染料优势明显，但其作为生物硫醇化学传感器的研究却相对较少。

为了解决上述问题，葡萄牙阿威罗大学的研究团队在《Dyes and Pigments》上发表了一项创新性研究。他们开发了一种从商业化颜料Pigment Red 254出发，简便合成基于DPP核心的新型马来酰亚胺衍生物的策略，并系统评估了这些新化合物作为“荧光开启”探针检测Cys、Hcy和GSH的性能。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几个关键技术方法：首先，他们通过优化烷基化反应条件，高效合成了关键的DPP中间体。其次，利用布赫瓦尔德-哈特维格酰胺化反应（Buchwald–Hartwig amidation）将氯原子转化为氨基前体，并巧妙控制脱保护条件，选择性获得了单氨基和双氨基DPP衍生物，为后续功能化奠定了基础。最后，通过经典的马来酸酐开环/环化反应，成功将马来酰亚胺单元引入到DPP骨架上，合成了目标探针分子。

结果与讨论

DPP衍生马来酰亚胺的合成

研究人员设计并合成了三个主要目标分子：对称的双马来酰亚胺衍生物（化合物5）以及两个非对称的单马来酰亚胺衍生物（化合物8和9）。合成路线以商品化的Pigment Red 254为起始原料，经过N-烷基化、Buchwald–Hartwig酰胺化、选择性Boc（叔丁氧羰基）保护基脱除以及最后与马来酸酐反应并环化等步骤。该合成路线的显著优点在于步骤简洁，特别是化合物5从中间体1到最终产物无需中间纯化步骤，总产率达到56%，远高于许多已报道的DPP基硫醇探针（通常<10%），体现了良好的实用性和可放大潜力。

光物理性质

在DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中测试了化合物5、8、9以及尝试合成的延伸π-共轭分子13的光物理性质。结果表明，打破分子对称性（如化合物8、9相对于5）会导致吸收和发射光谱红移，并提高摩尔吸光系数。所有探针均表现出较大的斯托克斯位移（66-73 nm）。值得注意的是，尽管马来酰亚胺单元对DPP核心的荧光有淬灭作用，但将马来酰亚胺与DPP核心通过苯环间隔开（如化合物13）后，其荧光量子产率（Φ_F）显著提高至0.41，说明增加距离可以有效减弱淬灭效应。

硫醇传感性能

在DMF/H₂O (1:1)的混合溶剂中评估了探针5、8、9对Cys、Hcy和GSH的检测能力。所有探针在与硫醇反应后均表现出显著的荧光增强效应（“开启”效应）。

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  化合物5（双马来酰亚胺）：对Cys、Hcy和GSH的检测限（LOD）分别为123 nM, 115 nM和96 nM。响应时间方面，Cys最快（2-3分钟），Hcy次之（约7分钟），GSH最慢（约150分钟），显示出对Cys和Hcy的动力学选择性。
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  化合物8（单马来酰亚胺）：表现出更优异的灵敏度，对Cys、Hcy和GSH的LOD分别达到18 nM, 46 nM和28 nM。响应时间也进一步缩短，Cys和Hcy分别在5分钟和4分钟内达到最大信号，而GSH仍需130分钟。这表明单个马来酰亚胺单元足以有效淬灭荧光，并在硫醇加成后实现更高效的荧光恢复。
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  化合物9（另一单马来酰亚胺）：虽然显示出最大的斯托克斯位移（73 nm），但其荧光强度在达到一定硫醇浓度后出现下降，不适合定量检测。

选择性

探针5和8在面对其他氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸等）、D-葡萄糖、阴离子活性硫物种（HS^-, HSO₃^-）以及常见生物阳离子时，均未引起显著的荧光增强，证明了对生物硫醇的高选择性。

稳定性

稳定性测试表明，化合物5及其与Cys的加合物在溶液（DMF/H₂O）中，无论在黑暗还是白光照射下，1小时内均保持高度稳定。化合物8本身在溶液中稳定性稍差，其荧光会随时间缓慢增强，推测是由于微量水解生成了荧光更强的马来酰胺酸。然而，8与Cys或Hcy的反应非常迅速（几分钟内），且生成的加合物稳定性良好，因此仍适用于传感应用。此外，在pH 5-10范围内，两种探针与Cys反应后的加合物荧光强度基本一致，表明其适用于广泛的生物pH环境。

传感机制

通过核磁共振氢谱（¹H NMR）和质谱分析证实了检测机制：硫醇对马来酰亚胺双键的迈克尔加成反应。反应后，马来酰亚胺特征质子信号消失，并出现了相应的琥珀酰亚胺质子信号，明确证明了硫醇-马来酰亚胺加合物的形成。

结论与意义

本研究成功开发了一条从廉价易得的原料出发，高效合成基于DPP核心的新型马来酰亚胺荧光探针的路线。所制备的探针（尤其是化合物5和8）在检测生物硫醇时表现出高灵敏度（低至nM级别的检测限）、快速的响应时间（对Cys/Hcy仅需数分钟）、较大的斯托克斯位移（约70 nm）以及良好的选择性。化合物8对Cys的检测限低至18 nM，是迄今报道的性能最优异的DPP基硫醇探针之一。这些探针的合成产率高、稳定性好，其检测限远低于生物体液中硫醇的生理浓度，显示出在体外诊断、生物流体中硫醇含量监测等方面的巨大应用潜力。与以往报道的许多DPP基或其他类型的硫醇探针相比，本研究开发的探针在合成简便性、反应速度、检测灵敏度等方面均展现出明显优势，为开发新一代高性能生物硫醇检测工具提供了有价值的参考。