草甘膦通过视黄酸依赖的six3b表达下调损害斑马鱼幼鱼视觉功能

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Glyphosate exposure impairs visual function in zebrafish larvae through retinoic acid-dependent regulation of six3b expression

本研究针对环境残留草甘膦(GLY)的视觉毒性机制不明确的问题，通过斑马鱼模型发现环境相关浓度GLY暴露可通过抑制视黄酸(RA)合成酶表达降低RA浓度，进而下调视觉发育关键基因six3b表达，导致视神经发育不全和视觉行为异常。研究首次揭示RA-six3b轴在GLY视觉毒性中的核心作用，为农药生态风险评估提供新靶点。

　　

随着草甘膦(GLY)这一"世纪除草剂"的广泛使用，其在环境中的残留浓度不断升高，甚至在人体尿液样本中也能检测到显著升高的草甘膦水平。尽管各国制定了水中草甘膦的最大残留限量（0.1 μg/L至1.4 mg/L），但由于其生物学效应和毒性机制尚不明确，这些安全限值一直存在争议。特别值得关注的是，流行病学研究发现职业性草甘膦暴露与视觉系统损伤相关，包括眼刺激、结膜炎和视觉功能障碍，然而草甘膦对视觉系统毒性的分子机制仍知之甚少。

为深入探究这一问题，研究人员在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了最新研究成果，利用斑马鱼模型系统研究了环境相关浓度草甘膦暴露对视觉系统的毒性效应及其分子机制。研究发现，虽然草甘膦暴露不影响斑马鱼幼鱼的基本发育参数，但会显著损害其视觉运动反应(VMR)和光动反应(OMR)，这种视觉行为异常与视神经发育不全密切相关，而背后隐藏的分子机制则涉及一条全新的信号通路。

研究团队采用了一系列关键技术方法开展此项工作。他们使用野生型AB品系斑马鱼和six3b过表达转基因斑马鱼胚胎，在受精后5小时(hpf)开始暴露于环境相关浓度的草甘膦(0.14-2.8 mg/L)直至144 hpf。通过视觉运动反应和光动反应测试评估视觉功能，采用组织学染色观察视神经形态，运用qRT-PCR和Western blotting分析基因和蛋白表达变化，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测视黄酸浓度。此外，研究还通过显微注射技术构建six3b过表达斑马鱼模型，并利用外源性视黄酸补充实验验证信号通路关系。

3.1. 暴露于环境相关浓度的GLY不影响斑马鱼的基本发育

研究人员首先评估了草甘膦暴露对斑马鱼基本发育参数的影响。结果显示，0-2.8 mg/L的草甘膦暴露对72 hpf的孵化率、120 hpf的死亡率和畸形率以及144 hpf的眼径均无显著影响，表明这些环境相关浓度的草甘膦不会损害斑马鱼的基本发育过程。

3.2. 环境相关GLY暴露干扰视觉行为和视神经发育

在视觉功能评估中，研究人员发现≥0.7 mg/L的草甘膦暴露会导致斑马鱼幼鱼在光相活动距离显著增加，而暗相活动保持不变，这种光特异性多动表明存在视觉调节缺陷而非一般运动障碍。在光动反应测试中，0.7、1.4和2.8 mg/L草甘膦显著降低了总OMR事件和阳性选择百分比。组织学分析进一步发现，1.4 mg/L草甘膦暴露特异性导致视神经变薄，为行为损伤提供了结构基础。

3.3. six3b介导GLY诱导的斑马鱼幼鱼视觉损伤

在分子机制探索中，研究人员检测了六个候选视网膜转录因子，发现只有six3b在1.4 mg/L草甘膦暴露下被选择性下调，相应的Six3蛋白表达也同步降低。为验证因果关系，研究团队通过显微注射构建了six3b过表达斑马鱼模型，发现six3b过表达能完全恢复草甘膦暴露斑马鱼的Six3蛋白水平，并挽救光动反应缺陷，证明six3b位于草甘膦下游，且足以逆转视觉表型。

3.4. GLY通过RA耗竭抑制six3b从而引发视觉损伤

进一步机制研究表明，1.4 mg/L草甘膦暴露显著降低了斑马鱼幼鱼体内的视黄酸浓度及其关键合成酶(aldh1a2和aldh1a3)的转录水平。外源性补充视黄酸(0.3 μg/L)可恢复内源性RA水平，正常化光动反应性能，并逆转视神经变薄。重要的是，视黄酸补充完全挽救了草甘膦诱导的six3b下调，确定six3b位于视黄酸下游，揭示了RA-six3b轴是草甘膦引发视觉功能障碍的关键通路。

研究结论与讨论部分强调，这项工作系统阐明了环境相关浓度草甘膦通过视黄酸依赖的six3b表达下调导致视神经发育不全，进而损害视觉行为的毒性机制。这一发现不仅明确了草甘膦视觉毒性的分子基础，也丰富了农药暴露相关生态毒理学的认识。

与多溴二苯醚(PBDE)等污染物主要干扰视黄醇转运和储存不同，草甘膦特异性靶向视黄酸合成酶来降低视黄酸水平，进而抑制six3b表达。这种差异反映了污染物干扰视黄酸信号通路的分子途径多样性，同时凸显了视黄酸在维持视觉系统稳态中的核心作用。

值得注意的是，研究未观察到pax6a表达的显著变化，这表明在草甘膦暴露的斑马鱼幼鱼特定发育背景下，视黄酸介导的six3b调控可能独立于pax6a，或者pax6a经历了短暂或组织特异性调控，这凸显了视黄酸信号通路的复杂性。

这项研究的创新之处在于首次将视黄酸-six3b轴确定为草甘膦诱导视觉毒性的新靶点，为理解环境污染物对视觉系统的损害机制提供了重要见解。研究结果强调，在视觉毒理学研究中需要优先考虑功能测定，因为污染物可能会破坏视觉神经回路的完整性而不改变大体眼部结构。未来通过单细胞转录组学解析视黄酸、six3b和其他视网膜发育相关基因之间复杂的调控网络，将有助于更全面理解环境污染物对视觉系统的毒性效应。

该研究不仅为草甘膦的生态风险评估提供了科学依据，也为预防和干预农药相关视觉系统损伤提供了潜在靶点。随着环境中农药残留问题的日益突出，这类研究对保护水生生态系统和人类健康具有重要的现实意义。