Myclobutanil通过内质网应激与自噬途径诱导小鼠睾丸损伤及生殖细胞凋亡的机制研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Myclobutanil-induced testis damage and apoptotic germ cell death through ER stress and autophagy in mouse testes

本研究针对三唑类杀菌剂Myclobutanil (MYC)的生殖毒性问题，通过体内外模型揭示了MYC通过激活内质网应激(ER stress)与自噬(autophagy)通路诱导睾丸生殖细胞凋亡的新机制。研究发现150 mg/kg MYC处理8周可显著抑制小鼠生精细胞、支持细胞和间质细胞基因表达，降低精子活力，并证实自噬抑制剂3-MA可缓解MYC诱导的GC1-spg细胞凋亡，为防治MYC生殖风险提供了理论依据。

　　

随着现代农业的发展，三唑类杀菌剂在作物病害防治中发挥着重要作用，然而这类化学物质对生态环境和生物健康的潜在风险日益引发关注。其中，Myclobutanil（MYC）作为一种高效的三唑类杀菌剂，通过抑制真菌细胞膜关键成分麦角固醇的合成来发挥杀菌作用，虽被认为对人类和动物毒性较低，但已有研究提示其可能存在的生殖毒性风险。在雄性生殖健康领域，环境污染物对睾丸功能的损害已成为全球范围的公共卫生问题，但MYC对男性生殖系统的具体毒性机制尚不明确。

在此背景下，由Ran Lee、Won-Young Lee、Dong-Wook Kim和Hyun-Jung Park组成的研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了题为"Myclobutanil-induced testis damage and apoptotic germ cell death through ER stress and autophagy in mouse testes"的研究论文。该研究系统探讨了MYC暴露对雄性生殖系统的毒性效应及其分子机制。

研究人员采用体内外相结合的研究策略，主要运用了动物模型构建（8周龄CD-1雄性小鼠口服150 mg/kg MYC，每周五次，持续8周）、计算机辅助精子分析(CASA)技术、免疫组织化学染色、 Western blotting蛋白质印迹分析、细胞培养（小鼠GC1-精原细胞系）以及流式细胞术等关键技术方法。其中动物实验遵循Sangji大学动物护理和使用委员会指南，细胞实验则使用韩国细胞系银行提供的GC1-spg细胞系进行研究。

3.1. MYC对小鼠睾丸细胞的影响

通过8周的口服暴露实验，研究发现MYC处理虽未影响小鼠总体体重，但显著降低了睾丸大小和重量。组织学分析显示生精小管直径减小，免疫染色发现DDX4⁺细胞数量减少，SYCP3⁺减数分裂细胞明显减少。基因和蛋白水平分析进一步证实，MYC显著下调了生精细胞标志物（SYCP3、DMC1）、支持细胞标志物（WT1、SOX9）和间质细胞标志物（3β-HSD1等）的表达，同时血清睾酮水平降低，表明MYC对睾丸三种主要细胞类型均产生不利影响。

3.2. MYC通过ER应激和自噬诱导睾丸生殖细胞凋亡

分子机制研究表明，MYC处理上调了内质网应激标志物（GRP78/BiP、ATF4、XBP1、IRE1）、自噬相关基因（ATG5、ATG12、BECN1、Ulk1、BNIP3）和凋亡相关基因（Bax、Bad、p53）的表达。免疫组化显示GRP78/BiP阳性细胞分布于生精小管管腔边缘，而LC3A/B和Cleaved Caspase-3阳性细胞主要位于基底膜附近。蛋白质印迹分析证实BECN1、GRP78/BiP、PDI、Cleaved Caspase-3和BAD蛋白表达增加，表明ER应激、自噬和凋亡通路在睾丸组织中被激活。

3.3. MYC对小鼠附睾精子参数的影响

精子功能分析显示，MYC处理显著降低精子活力(%)、快速前进(%)和慢速前进比例，同时增加不动精子(%)和非前进精子比例。精子运动参数中VSL(μm/s)、LIN(%)和STR(%)显著降低。形态学分析发现MYC处理组异常精子（头部畸形和颈部缠绕）比例显著增加，但顶体反应未见明显差异。

3.4. MYC在GC1-spg细胞中诱导ER应激介导的自噬性细胞死亡

体外实验发现MYC对GC1-spg细胞具有剂量依赖性细胞毒性，IC₅₀为106.14 μM。100 μM MYC处理24小时显著增加细胞凋亡率， Annexin V-FITC/PI染色显示凋亡细胞比例升高。免疫染色和Western blotting证实Cleaved Caspase-3、BAD和磷酸化p53表达增加。同时，MYC促进自噬和ER应激，表现为LC3A/B免疫染色增强，ATG5、ATG3、BECN1、LC3A/B、GRP78/BiP和PDI蛋白表达上调。

3.5. 3-MA减轻MYC诱导的GC1-spg细胞自噬

为验证自噬在MYC诱导细胞死亡中的作用，研究人员使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)进行干预。结果显示，3-MA与MYC共处理可下调MYC诱导的自噬相关基因（ATG12和BNIP3）表达，降低LC3A/B免疫反应性，并减弱自噬和凋亡标志蛋白的表达升高，表明抑制自噬可缓解MYC诱导的细胞凋亡。

研究结论与讨论部分强调，MYC通过启动ER应激、激活自噬并最终触发凋亡的级联反应，导致生殖细胞死亡。这一毒性机制与支持细胞和间质细胞功能受损共同作用，最终损害精子发生和男性生育能力。值得注意的是，本研究未观察到明显的活性氧(ROS)积累，提示MYC的生殖毒性可能主要通过ER应激-自噬-凋亡轴而非氧化应激途径介导。

该研究的创新之处在于首次系统阐明了MYC诱导睾丸生殖细胞凋亡的具体分子通路，特别是明确了ER应激与自噬在这一过程中的关键作用及相互关系。研究结果不仅为理解三唑类杀菌剂的生殖毒性机制提供了重要科学依据，也为开发针对MYC生殖风险的干预策略提供了潜在靶点。鉴于MYC在环境中的广泛存在及其通过食物链（如葡萄酒）进入人体的可能性，这项研究对评估农药使用的安全性和保护男性生殖健康具有重要的公共卫生意义。