小鼠CYP2E1相对于人CYP2E1在代谢活化低氯联苯诱导基因突变方面的劣势：分子对接/动力学研究揭示小鼠酶的不利代谢活化作用

本研究针对低氯联苯（L-CBs）的代谢活化及致突变性，比较了常用动物模型小鼠与人类CYP2E1酶的差异。通过分子对接/动力学模拟和Hprt基因突变试验，发现人CYP2E1可激活更多L-CBs产生致突变效应，而小鼠CYP2E1的底物覆盖范围和催化效率均较低，其酶蛋白通道通量亦显弱势。结果表明，小鼠模型可能不适用于准确评估L-CBs经CYP2E1代谢活化所致的人类健康风险，强调了种属差异在毒理学研究中的重要性。

　　

多氯联苯（PCBs）是一类典型的持久性有机污染物，尽管已被禁用多年，但由于其化学稳定性、难降解性以及非故意排放（如含氯有机物热解、电子垃圾拆解等），它们仍然广泛存在于全球环境中，对生态系统和人类健康构成持续威胁。多氯联苯的毒性复杂多样，其中一些低氯代联苯（L-CBs，指每个分子含有1-5个氯原子的同类物）在环境介质（如空气、土壤）中更为丰富，并且更容易被代谢。值得注意的是，代谢过程可能是一把“双刃剑”：一方面它可能促进污染物的清除，另一方面也可能导致“代谢活化”，即生成毒性更强、甚至具有致突变性和致癌性的活性代谢物。已有研究表明，某些L-CBs的致突变性依赖于人类细胞色素P450酶（特别是CYP2E1）的活化。然而，在毒理学研究中广泛使用的小鼠模型，其CYP2E1酶在活化L-CBs方面的能力如何？是否能很好地模拟人类的情况？这对于准确评估L-CBs的人类健康风险至关重要，但目前尚不清楚。种属差异可能导致基于动物实验的外推结果不准确，从而影响对污染物人体风险的判断。

为了解决这一问题，发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上的这项研究，巧妙地结合了计算机模拟和体外实验方法，系统比较了小鼠和人类CYP2E1酶在代谢活化L-CBs并诱导基因突变方面的差异。研究人员首先通过分子对接技术，预测了23种单氯至三氯联苯与人和小鼠CYP2E1酶活性位点的结合情况。然后，他们利用经过基因工程改造的中国仓鼠V79衍生细胞系——分别表达人CYP2E1（V79-hCYP2E1-hSULT1A1）或小鼠CYP2E1（V79-mCYP2E1）——进行Hprt（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）基因位点突变试验，直接检测了部分L-CBs在这些细胞中的致突变性。对于在致突变性上表现出种属差异的化合物，研究进一步通过分子动力学模拟，深入分析了L-CBs分子进入两种CYP2E1酶活性位点的主要通道（隧道）的特征，从结构生物学的角度探寻潜在机制。

本研究采用的关键技术方法主要包括：分子对接（预测化合物与蛋白的结合模式和亲和力）、分子动力学模拟（分析蛋白质结构动态变化和底物通道特性）、基于基因工程细胞系（V79-mCYP2E1和V79-hCYP2E1-hSULT1A1）的Hprt基因突变试验（检测化合物在代谢活化条件下的致突变性），以及蛋白质印迹法（Western blot，验证细胞系中CYP2E1蛋白的表达水平）。

分子对接预测L-CBs对人和小鼠CYP2E1的底物潜力

研究人员对23种L-CBs进行了分子对接分析。判断一个化合物能否成为CYP2E1底物的标准包括：结合自由能得分（需为足够负值）、对接成功次数（50次运行中至少10次成功对接）、以及配体分子上最近的活性碳原子与血红素中心铁原子的距离（≤ 6.0 ?，以满足电子转移和催化反应的要求）。结果显示，有17种（74%）和9种（39%）化合物分别被预测为人和小鼠CYP2E1的潜在底物。值得注意的是，所有被预测为对人CYP2E1非底物的化合物，对小鼠CYP2E1也同样被预测为非底物。而在17种对人CYP2E1有潜力的底物中，仅有9种对小鼠CYP2E1也有潜力。这表明小鼠CYP2E1可能催化的L-CBs范围比人类的要窄。

人和小鼠CYP2E1主要通道通量的差异

酶活性位点深藏于蛋白质内部，底物需要通过特定的“隧道”才能进入。分子动力学模拟分析了在无配体存在时，人和小鼠CYP2E1蛋白中通向活性位点的最主要三个隧道的特点。关键指标“优先级”综合反映了隧道出现的频率和瓶颈尺寸等因素。研究发现，人CYP2E1主要隧道的“优先级”（0.379, 0.312, 0.239）显著高于小鼠CYP2E1的对应隧道（0.113, 0.077, 0.075），高出约2-5倍。这意味着底物分子进入人CYP2E1活性位点的“便利程度”远高于小鼠同源酶。

细胞系中CYP2E1蛋白的表达水平

为了确保后续突变试验结果的可靠性，研究通过蛋白质印迹法验证了细胞系中CYP2E1的表达。结果证实，亲本V79-Mz细胞不表达可检测到的CYP2E1蛋白，而V79-mCYP2E1和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞则分别稳定表达了小鼠和人的CYP2E1蛋白，且表达水平相当，没有统计学显著差异。这排除了因酶表达量不同而导致后续致突变性差异的可能性。

L-CBs在表达不同CYP2E1的V79细胞中的致突变性

Hprt基因突变试验是检测基因突变的经典方法。研究人员选取了部分基于分子对接结果筛选的L-CBs进行测试，包括PCB 1、5、9、18、20、22和28。结果表明：

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  在亲本V79-Mz细胞（不表达代谢酶）中，所有测试化合物均未诱导突变频率显著升高，说明L-CBs本身不具有直接致突变性，其致突变性依赖于代谢活化。
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  在表达人CYP2E1的V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞中，除PCB 28外，其余6种化合物（PCB 1, 5, 9, 18, 20, 22）均能浓度依赖性地诱导Hprt基因突变，其中PCB 20和22的致突变性最强（最低有效浓度低至1 μM）。
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  在表达小鼠CYP2E1的V79-mCYP2E1细胞中，情况则大不相同：PCB 1和28为阴性（无致突变性），PCB 20的结果模棱两可；仅有PCB 9和18显示了阳性致突变反应，但其致突变强度（以单位浓度诱导的突变数衡量）远低于在人CYP2E1细胞中的效果。
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  作为阳性对照的N-亚硝基二甲胺（NDMA）在两种表达CYP2E1的细胞系中均能诱导突变，且效力相当，说明两种细胞系的代谢活化系统本身是有效的，且对已知底物的响应相似。

L-CBs作为配体对通道通量的影响

为了从机制上解释上述致突变性差异，研究进一步选取了在两种细胞中致突变性表现不同的PCB 1、5和9，进行分子动力学模拟，观察这些化合物作为配体通过主要隧道轨迹进入活性位点时对通道通量的影响。结果显示，无论以哪种PCB作为配体，其进入人CYP2E1活性位点的通道“优先级”均 consistently（一致地）高于进入小鼠CYP2E1的对应通道。

本研究通过整合计算机模拟和体外实验证据，得出明确结论：与人类CYP2E1相比，小鼠CYP2E1在代谢活化低氯联苯（L-CBs）并诱导基因突变方面处于劣势。这种劣势主要体现在两个方面：一是底物覆盖范围更窄（能催化的L-CBs种类更少）；二是对共有的底物，其催化效率（反映在致突变强度上）也可能更低。分子动力学模拟结果提示，这种功能差异可能源于两种酶在三维结构上的细微差别，特别是底物进入活性位点所依赖的“隧道”系统的通量差异，人CYP2E1的通道更为“通畅”，便于底物进出和代谢反应进行。

该研究的发现具有重要的毒理学意义。它明确指出，常用的小鼠动物模型可能无法准确模拟L-CBs经CYP2E1途径代谢活化所致的人类遗传毒性风险。在进行健康风险评估时，需要谨慎对待基于小鼠实验数据的外推，必须充分考虑种属间代谢能力的差异。此外，该研究也展示了结合计算毒理学（如分子对接、分子动力学）与体外生物学试验（如基于工程细胞系的致突变试验）的策略，在预测和验证污染物代谢活化途径及种属差异方面的有效性和可靠性。这对于未来评估其他需要代谢活化的环境污染物的毒性及其种属特异性提供了有价值的参考范例。最后，研究再次强调了L-CBs（尤其是某些特定结构的同类物，如PCB 20和22）在人体内被CYP2E1代谢活化后可能带来的基因突变风险，提醒我们需持续关注这类污染物对公众健康的潜在威胁。