多组学揭示脂质、氨基酸和核苷酸代谢在鳜幼鱼急性热应激与恢复中的关键作用

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Multi-omics analysis reveals the key roles of lipid, amino acid, and nucleotide metabolism in response to acute thermal stress and recovery in juvenile mandarin fish ( Siniperca chuatsi)

本研究针对全球变暖背景下极端高温事件对水生生物造成的热应激问题，通过整合转录组学和代谢组学分析，系统研究了鳜（Siniperca chuatsi）幼鱼在急性热应激（30°C和35°C）及恢复过程中的肝脏响应机制。研究发现，热应激导致进行性肝损伤，并引发脂质稳态破坏、免疫失衡及能量代谢重编程；恢复阶段则出现免疫信号再激活、促消退脂质介质积累及细胞骨架重塑。研究揭示了多不饱和脂肪酸、核苷酸和AMPK模块作为调控枢纽的关键作用，为理解淡水顶级捕食者对气候变暖的适应潜力提供了新见解。

　　

随着全球气候变暖加剧，极端高温天气事件日益频繁，对水生生态系统构成了严重威胁。水温是影响鱼类生理活动的关键环境因子，直接调控其生长、发育、免疫功能和代谢活性。在全球超过一半的淡水系统中，持续升温与剧烈波动已成为新常态。由城市热岛效应、工业排放及气候变化引发的突发性短期热浪，可在短时间内使水温超出鱼类的生理耐受极限，导致细胞损伤、免疫功能受损甚至大规模死亡。在这样的环境中，鱼类必须启动跨越分子、细胞和系统水平的多层次应激响应，以恢复生理稳态并缓解急性热暴露的影响。

鳜（Siniperca chuatsi）作为我国淡水生态系统中一种重要的肉食性鱼类，年产量超过30万吨，分布遍及20多个省份。然而，作为一种广温性捕食者，其对温度变化极为敏感，尤其是幼鱼阶段，具有较高的代谢率和不成熟的稳态调节能力，极易受到急性热应激的影响。肝脏作为能量代谢、营养处理和免疫调节的中心器官，是响应热应激的首要靶点，但也极易遭受热损伤。目前，关于鳜幼鱼肝脏在急性热应激及恢复过程中的分子机制尚不清楚。

为此，研究人员在《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》上发表了题为“Multi-omics analysis reveals the key roles of lipid, amino acid, and nucleotide metabolism in response to acute thermal stress and recovery in juvenile mandarin fish (Siniperca chuatsi)”的研究论文。该研究通过整合生理评估、转录组学和代谢组学分析，探讨了鳜幼鱼在急性热应激（25°C对照、30°C中度应激、35°C重度应激）及恢复（R35M）过程中的肝脏响应，识别了关键代谢途径和功能代谢物，并利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定了枢纽基因及其在维持细胞稳态和缓解热损伤中的调控作用。

本研究主要采用了组织病理学分析、超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）非靶向代谢组学、Illumina平台RNA测序（RNA-Seq）、转录因子（TF）预测与分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）以及实时定量PCR（RT-qPCR）验证等关键技术方法。实验鱼类（鳜幼鱼）来自广东东莞的养殖场，并在实验室条件下进行驯化。研究设计了对照（CT，25°C）、中度热应激（30 M，30°C）、重度热应激（35 M，35°C）和恢复（R35M，从35°C恢复至25°C）四个处理组，在每个处理结束时采集肝脏组织用于后续分析。

3.1. 热应激和恢复过程中肝损伤的组织学进展

组织学分析显示，热应激及恢复诱导了鳜幼鱼肝脏的显著病理改变。对照组肝细胞形态正常，结构完整。30°C处理组出现轻度病理变化，包括肝细胞肿胀、空泡化和细胞排列轻度紊乱。35°C处理组损伤加剧，表现为细胞边界不清、核固缩和碎裂以及实质结构破坏。恢复组则显示出明显的修复迹象，大部分肝细胞恢复结构完整性，仅存最小程度的空泡化，表明急性热应激可引起进行性肝损伤，而恢复过程能部分修复组织结构。

3.2. 热应激和恢复过程中肝脏代谢组学的改变

代谢组学分析共鉴定到1442个差异积累代谢物（DAMs），主要类别为脂质（336）、有机酸（188）、核苷（78）和有机杂环化合物（108）。PLS-DA得分图显示各组样本明显分离，恢复组样本虽靠近对照组但仍保持独立，表明96小时恢复后代谢并未完全复原。脂质相关DAMs在35°C应激组和恢复组中占比显著。伪时间聚类分析将代谢物分为6个簇，其中簇6（23个DAMs）的变化趋势与处理时间线最为一致，其代谢物如花生四烯酸、二十二碳五烯酸、UDP、GMP、精氨琥珀酸等，主要参与脂质代谢、核苷酸生物合成和氨基酸调节。

3.3. 热应激和恢复过程中肝脏转录组学的响应

转录组分析显示，与对照组相比，30°M组差异表达基因（DEGs）数量最多（1758个），且以下调为主；35°M组DEGs为1301个；恢复组（R35M）为1458个，但基因表达仍以抑制为主，表明尽管温度恢复，转录组扰动依然存在。GO富集分析表明，热应激主要扰乱了核糖体生物发生、rRNA加工和核糖核蛋白复合物组装。KEGG通路富集显示，30°M和35°M组显著富集于糖酵解/糖异生、趋化因子信号和AMPK通路；而恢复组则富集于肌动蛋白细胞骨架调控、FcγR介导的吞噬作用以及白细胞跨内皮迁移等通路。功能分类揭示了从应激期的代谢功能障碍到恢复期的组织修复、免疫清除的时序性转变。

3.4. 基因表达模式反映热适应和恢复

基因表达热图揭示了五个关键功能类别（代谢、应激反应、免疫活性、内分泌信号和结构重塑）在不同处理组中的特异性调控。在30°M和35°M组，糖酵解（gapdhs, pfkpa, ldha）和缺氧适应（egln2）相关基因显著下调，表明能量代谢受损。35°M组还出现蛋白质折叠和解毒基因（dnajc5ga, hsp90aa1.2, ern1, ero1a）的下调，反映细胞防御机制减弱。恢复组则出现细胞外基质组织和细胞骨架重塑相关基因（itga9, zyx, actb1）的上调，表明肝脏组织结构部分恢复，同时免疫相关基因（ctss2.1, stip1, il17ra1a）的持续激活反映了恢复阶段持续的免疫监视和清除活动。

3.5. 转录因子介导热应激和恢复下的调控转变

共鉴定出198个差异表达的转录因子，分属40个基因家族，其中zf-C2H2占比最大。在30°M和35°M组，免疫相关（Stat1, Irf5, Bcl6）和代谢调控（Ppara, Creb3l2）TF被广泛抑制，内质网应激相关TF（Atf6, Xbp1）也显著下降。恢复组则部分或完全重新激活了与组织修复和稳态相关的TF（Foxa2, Foxk2, Klf15, Srebf1, Cebpd）。蛋白质互作（PPI）网络分析确定了Jun、Myc和Fos等核心调控枢纽，它们在热应激下被抑制且在恢复期仅有限恢复，反映了细胞增殖和应激反应通路的转录控制未能完全复原。

3.6. WGCNA识别与代谢物积累相关的关键基因

WGCNA构建了13个基因共表达模块。其中，EM5（darkred）和EM13（tan）模块与簇6代谢物关联最强。EM5与大多数簇6代谢物呈负相关，功能富集于类固醇生物合成、外源物代谢和细胞衰老；EM13则呈正相关，富集于ECM-受体相互作用、AMPK信号和结构组织通路。Hub基因分析显示，col6a1、klf13、srfB等与脂质代谢物（如二十二碳五烯酸、EPA）强相关；fah、fdft1、glrx、nadk2、porb、sod1、tdo2a、ugt8等与能量相关中间体（UDP、GMP）相关；klf2b、p4ha1b、plekhm1、stk17a1、syde2、tgfbi等与有机酸（如γ-谷氨酰亮氨酸）正相关。这些枢纽基因将代谢抑制与免疫调节和结构修复联系起来。

3.7. 热应激和恢复分子响应的整合组学分析

整合分析揭示了不同阶段的协调响应机制。在30°M组，抗氧化基因（nrf1, cat, sod）激活但代谢物（如7-羟基香豆素、AMP）减少，表明抗氧化防御不足；自噬相关基因（ampk, ulk1, atg2）抑制提示细胞清除机制受损；同时，前列腺素E2减少及il6、il17下调反映了炎症反应减弱，可能是一种保护性适应。氮代谢重编程（asl表达上调，精氨琥珀酸减少）和核苷酸生物合成（UMP、UDP增加）可能通过钙信号和hsp70调控有助于短期适应。

在35°M组，脂质信号通路（2-花生四烯酰甘油醚、花生四烯酸、前列腺素E2下降，adcy1-cAMP-PRK-HSL通路抑制）严重破坏，增加了铁死亡 susceptibility。渗透调节模块中，甜菜碱显著减少，琥珀酰辅酶A、NAD、NADP⁺水平升高，γ-谷氨酰亮氨酸和pgx下调，表明渗透保护能力丧失，代谢向维持能量和氧化还原稳态倾斜。

在恢复组（R35M），免疫信号（细胞因子-细胞因子受体相互作用、B细胞受体信号、吞噬体形成）重新激活，促消退脂质介质（消退素E1、保护素D1）积累，il10上调有助于抗炎。ECM-受体相互作用和肌动蛋白细胞骨架调控通路富集，itgb1、肌动蛋白相关基因及黏着斑成分（ptk2, tln1, actn4）上调，表明细胞骨架重塑和ECM重建。糖酵解/糖异生和AMPK信号通路复苏，脂代谢（cpt1, srebf1）和核苷酸生物合成（UDP）基因上调，UDP积累可能通过rab7a和lamp2促进吞噬体成熟，耦合了能量代谢与免疫清除。

3.8. 转录组数据的定量qRT-PCR验证

随机选择8个基因进行RT-qPCR验证，其表达趋势与RNA-Seq结果高度一致（平均相关系数0.941），证实了转录组数据的可靠性。

本研究通过组织学、转录组和代谢组的整合分析，系统阐明了鳜幼鱼在热应激及恢复过程中的分子与生理轨迹。中度应激（30°C）激活了抗氧化转录响应但伴随代谢物耗竭，自噬抑制和炎症减弱，氮代谢重编程以维持短期稳态。重度应激（35°C）则破坏了脂质介导的炎症信号，耗竭渗透保护储备，迫使能量和氧化还原通路重定向，加剧肝损伤并增加铁死亡风险。恢复阶段虽出现免疫再激活、细胞骨架重塑和代谢复兴，但残留病变和持续偏差表明恢复不完全。WGCNA进一步揭示，以UDP、GMP和多不饱和脂肪酸为核心的代谢物动态，与AMPK信号枢纽基因紧密耦合，形成了协调损伤控制与修复的网络。

这项研究不仅明确了鳜幼鱼在热应激下的阶段性响应和部分恢复特性，为理解广温性鱼类的热适应机制提供了关键见解，而且对评估气候变暖对水生资源的影响、制定保护策略以及改善水产养殖中的热应激管理具有重要的科学意义和应用价值。研究揭示的不完全恢复现象尤其值得关注，提示未来需要更长时间的恢复观察以及针对长期适应性的深入探索。