用于靶向和非靶向暴露组学研究的干血斑分析

《Environmental Advances》：Dried blood spots analysis for targeted and non-targeted exposomics

干血斑（DBS）作为新生儿筛查的标准化样本，其化学暴露评估的潜力与局限性尚存争议。本研究系统比较了4种溶剂提取法对>200种环境污染物和代谢物的回收率（60-140%）及基质效应（中位数76%），发现优化溶剂组合（Acetonitrile/Methanol/Water）可显著提升检测稳定性。非靶向分析扩展了检测化学种类，成功识别12种真实样本中的暴露物（如PFAS、多酚），并首次在人类DBS中检出2-萘酚、2-苯基苯酚等环境污染物。代谢组学分析揭示了内源性代谢物（氨基酸、脂肪酸等）的多样性，证实DBS在整合暴露组学与代谢组学中具有可行性，但需注意基质效应（中位数76%）和样本保存条件的影响。

　　本研究围绕着一种新兴的生物样本类型——干血斑（Dried Blood Spots, DBS）展开，探索其在环境暴露组学（exposomics）与代谢组学（metabolomics）联合分析中的应用潜力。DBS作为一种微创采样方式，已在新生儿筛查中被广泛使用，用于监测多种代谢疾病。然而，尽管其应用前景广阔，DBS在多类化学物质的分析能力仍存在一定的局限性，特别是在提取效率和基质效应的全面评估方面。因此，本研究旨在优化一种基于液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）的工作流程，以便更高效地分析DBS中的化学暴露和代谢物信息。通过系统比较四种不同的提取方案，评估了超过200种结构多样的毒物、污染物和其他关键生物标志物的分析性能，最终选定了一种能够提供可接受回收率（60–140?%）和良好重现性（中位数RSD：18?%）的提取方法。此外，基质效应的中位数也达到了76?%，RSD为14?%，表明该方法具有一定的可靠性。

在实际应用中，研究团队对十二种暴露化合物进行了检测，这些化合物涵盖了不同的理化性质，其中包括一些首次在DBS中被报道的暴露标志物。通过非靶向分析（Non-Targeted Analysis, NTA），研究团队进一步扩展了可检测的化学空间，使得能够更可靠地识别其他潜在暴露物。同时，研究还成功识别了多种内源性代谢物，包括氨基酸、生物胺、脂肪酸和酰基肉碱等，表明该方法可以有效捕捉人类代谢组的广泛概况。这些结果支持DBS在整合暴露组学与代谢组学研究中的应用，为未来前瞻性与回顾性研究提供了毒理学和生物学上的见解。

### 1. 暴露组学的概念与发展

暴露组学是一种新兴的研究领域，最早由Wild在2005年提出，其核心理念是研究所有物理、化学、生物和心理社会因素对生物学的影响。随着研究的深入，这一概念在2012年得到了进一步的完善，并逐渐扩展至涵盖多种健康相关因素。暴露组学不仅关注环境暴露，还致力于理解这些暴露如何影响个体的健康，包括长期发展和疾病的发生。例如，一些研究指出，围产期、胎儿期和婴儿早期的暴露可能与神经退行性疾病、乳腺癌、心血管疾病、代谢综合征、不育和哮喘等疾病存在关联。因此，理解这些暴露的机制和影响对于预防和干预这些疾病具有重要意义。

然而，目前在孕前和婴儿期的暴露研究中，仍存在一些关键的局限性。首先，缺乏适用于广泛评估外源性物质的方法，这使得无法全面地进行风险评估。其次，关于共暴露的数据仍较为有限，难以进行系统性的分析。此外，大多数研究更倾向于在大规模的流行病学研究中使用DBS，而对这一样本类型在早期生命暴露研究中的潜力仍需进一步探索。尽管DBS已被广泛用于新生儿筛查，但在其作为暴露组学研究工具的使用上仍显不足。因此，了解DBS的真正潜力和限制对于推动其在早期生命暴露研究中的应用至关重要。

### 2. 研究方法与实验设计

本研究采用了多种化学物质作为分析对象，涵盖了包括邻苯二甲酸酯（phthalates）、全氟烷基物质（perfluoroalkyls substances, PFAS）、对羟基苯甲酸酯（parabens）、多酚（polyphenols）、霉菌毒素（mycotoxins）、植物雌激素（phytoestrogens）等在内的多个化学类别。研究团队通过一系列实验步骤，包括血液样本的采集、DBS的制备、提取、质谱分析和数据处理，来评估这些化学物质在DBS中的检测性能。

首先，血液样本从六位健康成人受试者中采集，其中三位为男性，三位为女性。通过指尖采血的方式，制作了五份DBS样本，并使用Whatman 903 Protein Saver卡进行储存。随后，研究团队制备了定量DBS（qDBS）样本，包括未加标和加标两种类型。未加标样本用于初步评估，而加标样本则用于后续的定量分析。为了确保实验的准确性，研究团队采用了标准化的提取和分析流程，并对所有样本进行了严格的质量控制。

在提取过程中，研究团队测试了四种不同的溶剂混合物，以评估其对化学物质回收率和基质效应的影响。这些溶剂包括不同比例的乙腈、甲醇、MTBE和水，其中部分溶剂混合物还加入了1%的甲酸。通过系统比较这四种提取方案，研究团队发现其中一种混合物能够提供最佳的回收率和基质效应控制。此外，为了评估血液样本的血细胞比容（haematocrit）对提取效果的影响，研究团队还进行了相应的实验。

在质谱分析阶段，研究团队采用了高分辨率质谱（HRMS）技术，并结合了数据依赖型（Data-Dependent Acquisition, DDA）和数据非依赖型（Data-Independent Acquisition, DIA）两种模式，以最大化碎片谱的生成并提高代谢物注释的准确性。通过这种方式，研究团队不仅能够检测到目标化合物，还能够发现一些未被预期的暴露物和代谢物。为了确保分析的可靠性，研究团队还使用了多个质量控制样本，并对所有样本进行了重复分析，以减少实验误差。

### 3. 实验结果与讨论

在实验结果中，研究团队发现，四种不同的提取方案在回收率和基质效应方面表现各异。其中，Ext#1和Ext#3在目标化合物的检测中表现出相似的性能，而Ext#2和Ext#4则显示出更高的数据变异性。考虑到实际操作的便利性以及高挥发性溶剂如MTBE的使用难度，研究团队最终选择了Ext#1作为最佳提取方案。该方案在回收率方面表现良好，且基质效应较为可控。

在检测到的化合物中，有11种被成功识别，其中8种的浓度可以较为准确地估算。这些化合物涵盖了多种化学类别，包括工业污染物（如酚类物质和PFAS）、农药（如三嗪类化合物）、饮食标志物（如多酚类物质）以及吸烟标志物（如尼古丁衍生物）和化妆品成分（如对羟基苯甲酸酯）。值得注意的是，一些化合物如2-萘酚、4-甲基苯并呋喃和阿特拉津（atrazine）在DBS样本中被首次检测到，表明该方法具有一定的新颖性和实用性。

此外，研究团队还对非靶向分析进行了评估，发现这种方法能够显著扩展可检测的化学空间。通过非靶向分析，研究团队不仅能够识别一些未被目标分析所涵盖的暴露物，还能够更全面地了解样本中的代谢物组成。例如，睾酮（testosterone）和甘胆酸（glycocholic acid）的检测结果与受试者的性别一致，表明该方法能够有效区分不同性别个体的代谢物水平。同时，一些与饮食相关的化合物如咖啡因和胡椒碱（piperine）也显示出显著的个体差异，进一步验证了该方法在识别暴露模式方面的有效性。

在非靶向分析中，研究团队还检测到了一些药物如加巴喷丁（gabapentin），尽管没有受试者主动报告其使用情况。这表明，一些药物可能通过其他途径进入人体，如通过食物链或环境暴露。此外，研究团队还发现，使用单个DBS小孔（punch）可能会影响某些化合物的检测频率，因此建议在分析中使用整个DBS斑点以提高样本的代表性。

### 4. 方法的局限性与未来展望

尽管本研究在优化DBS分析方法方面取得了一定的进展，但仍存在一些局限性。首先，目前的实验仅限于少量样本，尚未在大规模新生儿队列中进行验证。其次，该方法在定量分析方面仍存在一定挑战，特别是在某些化合物的背景污染问题上。为了提高定量分析的准确性，研究团队建议在样本制备过程中加入内标，并增加重复样本的数量。此外，血细胞比容的差异可能会影响某些化合物的检测结果，因此在未来的研究中，需要进一步评估不同血细胞比容对分析性能的影响。

此外，研究团队还指出，该方法在某些化合物的稳定性评估方面存在不足，特别是在历史样本的应用中。因此，未来的研究应考虑对样本的长期稳定性进行系统评估。同时，为了提高方法的适用性，研究团队建议进一步扩展分析的化合物种类和化学类别，以覆盖更多的暴露源。最后，研究团队强调，该方法在大规模应用中仍需进行优化，包括使用96孔板进行样本制备以及引入自动化系统以提高分析效率。

### 5. 结论与研究意义

本研究展示了一种基于高分辨率质谱的优化工作流程，用于DBS样本的暴露组学和代谢组学联合分析。该方法在回收率、基质效应、重现性和检测限（LOD）方面均表现出良好的性能，特别是在处理低浓度环境和饮食相关外源性物质时。尽管DBS样本通常含有极低浓度的化学物质，但该方法仍能够提供可靠的分析结果，为未来的新生儿暴露研究提供了重要的技术基础。

本研究的成果不仅有助于推动DBS在暴露组学中的应用，还为新生儿筛查程序中的化学暴露监测提供了新的视角。考虑到DBS样本的广泛储存和使用，未来的研究应进一步利用这些历史样本，以评估长期暴露对健康的影响。此外，研究团队建议在实际应用中，采用配对样本-空白样本分析，以减少背景污染的影响，并确保分析结果的准确性。通过进一步的优化和验证，DBS有望成为一种高效、经济的生物样本类型，用于大规模的暴露组学研究。