利用Komagataella phaffii高效表达Priestia flexa来源的β-淀粉酶及其V180A突变体在工业麦芽糖生产中的应用潜力

本研究首次在Komagataella phaffii中成功表达了来自两种Priestia flexa菌株的β-淀粉酶（β-amylase）AmyPf1和AmyPf2，并通过定点突变获得V180A突变体。该突变体展现出卓越的催化性能（比活性4009 U•mg?1，kcat 6656 s?1）和工业应用潜力（发酵酶活5130 U•mL?1，麦芽糖产率87.56%），为微生物源β-淀粉酶的工业化生产提供了新策略。

　　

Highlight

微生物β-淀粉酶是极具商业价值的酶制剂，但其工业化应用仍受限于高产菌株的缺乏。寻找适合β-淀粉酶高效表达的宿主系统是一项挑战，同时开发具有更优技术特性的β-淀粉酶也至关重要。

迄今为止，利用甲基营养型酵母——特别是Komagataella phaffii——作为生产微生物β-淀粉酶的表达平台尚未见报道。在本研究中，我们首次在K. phaffii中表达了来自P. flexa的β-淀粉酶基因，并研究了重组酶的生化特性。

Conclusions

本研究首次证明了利用甲基营养型酵母K. phaffii作为宿主，在补充玉米浆的低成本基本培养基中高效表达P. flexa来源β-淀粉酶的可行性。在这些培养基中生产酶可以显著降低制造成本，因为目前用于培养β-淀粉酶生产菌的富营养培养基价格要高得多。

两种重组β-淀粉酶AmyPf1和AmyPf2在K. phaffii中成功表达。它们表现出相似的最近温度（55°C）和最近pH（pH 8.0），并且在55°C和宽pH范围（4.0–10.0）内具有高稳定性。值得注意的是，AmyPf2的比活性（3836 U•mg^?1）和催化常数k_cat（6367 s^?1）均高于AmyPf1（分别为3411 U•mg^?1和4224 s^?1）。对两种β-淀粉酶氨基酸序列的比较揭示了四个残基差异。将AmyPf2特有的替换通过定点突变引入AmyPf1序列后发现，V180A突变显著提高了所得r-V180A变体的比活性（4009 U•mg^?1）和k_cat（6656 s^?1）。在补料分批发酵中，r-V180A的酶活达到5130 U•mL^?1。使用r-V180A与普鲁兰酶（一种淀粉脱支酶）联合水解玉米淀粉，获得了87.56%的麦芽糖产率，表明得到了高麦芽糖含量的水解产物。这些结果凸显了重组r-V180A酶在工业麦芽糖生产中的潜力，并肯定了K. phaffii表达系统用于高效生产P. flexa β-淀粉酶的实用性。