酶活性门控的PER-CRISPR/Cas12a级联信号放大技术用于H1N1病毒超灵敏检测

《Epilepsy & Behavior Reports》：An H1N1 virus biosensor based on enzyme activity-gated PER-CRISPR/Cas12a cascade signal amplification

本研究创新性地构建了一种基于DNA聚合酶活性调控的级联信号放大生物传感器，通过分子锁钥机制将H1N1 RNA识别转化为酶活性释放信号，结合PER（Primer Exchange Reaction）扩增与CRISPR/Cas12a反式切割实现三重信号放大。该平台检测限达25 fM，具备高特异性与可编程性，为现场快速诊断提供了新策略。

　　

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试剂与仪器

上海生工生物工程有限公司合成了所有寡核苷酸引物和荧光报告探针（表S1）。脱氧核苷三磷酸（NTP）混合物、HiScribe? T7高产RNA合成试剂盒和Monarch? RNA纯化试剂盒购自新英格兰生物实验室（美国伊普斯威奇）。DNase/RNase-free水购自索莱宝生物（北京），T7 RNA聚合酶购自宝生物工程（Takara），Taq DNA聚合酶购自北京索莱宝科技有限公司。

实验原理

当目标H1N1病毒存在时，其会与抑制剂竞争结合拮抗剂，导致分子开关结构被破坏，抑制剂脱落，从而恢复Taq DNA聚合酶的活性（图1）。激活的Taq DNA聚合酶在dNTP（2.5 mM）、引物（4 μM）和甲氧基修饰的发夹DNA（1.5 μM）存在下，通过引物交换反应（PER）生成Cas12a激活剂。该激活剂与crRNA（1 μM）结合后，可触发Cas12a的反式切割活性，切割HEX/BHQ1双标记的报告基因，产生荧光信号。

结论

本研究成功构建了一种基于酶活性门控机制的PER-CRISPR/Cas12a级联信号放大生物传感器，实现了对H1N1流感病毒核酸的高灵敏、高特异性检测。通过创新性地设计DNA抑制剂与Taq DNA聚合酶的动态复合物，该系统将目标RNA的识别事件直接转化为酶活性调控信号，避免了目标直接参与扩增带来的交叉污染风险。