基于UPLC-Orbitrap-MS/MS技术的黄精低聚糖成分分析及其抗非酒精性脂肪肝活性研究

《Food Hydrocolloids for Health》：Profiling oligosaccharide components in Polygonatum kingianum with potential anti-NAFLD activity using UPLC-Orbitrap-MS/MS technology

本研究针对黄精低聚糖结构解析困难的问题，采用UPLC-Orbitrap-MS/MS技术系统表征了黄精低聚糖组分。研究人员通过建立基于特征二级碎片离子和保留时间的分析方法，首次从黄精中鉴定出34种低聚糖，发现其具有(1→2)和(2→6)糖苷键连接的果糖骨架结构，并在DL-乙硫氨酸诱导的脂肪肝小鼠模型中验证了其肝保护作用。该研究为黄精抗NAFLD活性成分研究提供了新方法。

　　

在传统中医药宝库中，黄精（Polygonatum kingianum）作为药食同源的珍贵药材，自古就有"仙人余粮"的美誉。现代研究发现黄精富含多种生物活性成分，其中碳水化合物尤其是多糖成分备受关注。然而，相对于研究较多的多糖成分，黄精中的低聚糖组分由于其结构复杂性和分析技术的限制，研究相对滞后。低聚糖作为由2-10个单糖单元组成的碳水化合物，具有分子量小、结构明确、生物利用度高等优势，在代谢性疾病干预方面展现出巨大潜力。

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）作为全球最常见的慢性肝脏疾病之一，成人患病率高达25%，其病理进程与肥胖、胰岛素抵抗密切相关。近年来，天然低聚糖因其安全性高、多靶点调控等特点，成为NAFLD治疗研究的新方向。然而，黄精低聚糖在缓解脂肪肝进展方面的活性研究却鲜有报道。

碳水化合物分析长期以来面临诸多挑战，由于存在同分异构体且缺乏紫外吸收，传统表征方法如核磁共振谱法灵敏度不足且对样品纯度要求严格。虽然化学衍生化策略可以增强检测响应，但过程复杂耗时。为此，研究人员创新性地采用超高效液相色谱-轨道阱质谱联用技术（UPLC-Orbitrap-MS/MS），该技术整合了UPLC的高分离效率与Orbitrap的高分辨质谱能力，能够在无需复杂预处理步骤的情况下，精确分析复杂基质如中药材中的碳水化合物成分。

本研究团队针对黄精低聚糖的结构复杂性和对照品缺乏的问题，通过水提醇沉和膜过滤技术获得了黄精活性粗低聚糖组分，并建立了系统的UPLC-Orbitrap-MS/MS分析方法。结合甲基化分析，研究人员成功从黄精中鉴定出34种低聚糖同系物，这些化合物偏离了传统的五类果聚糖分类系统，主要呈现龙舌兰型结构特征，即以(2→6)连接的果糖骨架为主链，带有(2→1)分支的呋喃糖残基。

关键技术方法包括：通过热水提取、60%无水乙醇沉淀和膜分离技术富集黄精低聚糖组分；利用UPLC-Orbitrap-MS/MS建立基于特征二级碎片离子和保留时间曲线的分析方法；采用甲基化分析和GC-MS确定糖苷键连接模式；通过DL-乙硫氨酸诱导的脂肪肝小鼠模型验证黄精低聚糖的肝保护活性。

研究结果方面，通过单糖组成分析发现黄精低聚糖中果糖与葡萄糖的比例为4.12:1，表明黄精低聚糖主要为果寡糖（FOS）。动物实验结果显示，黄精低聚糖各组分（PK-A1、PK-D1、PK-D2）在50 mg/kg剂量下能显著降低DL-乙硫氨酸诱导的脂肪肝小鼠血清ALT和AST水平，表现出显著的肝保护作用。

甲基化分析确定了黄精低聚糖中的六种连接类型，包括末端果呋喃糖（Fruf）、末端葡萄吡喃糖（Glcp）、(2→6)连接的Fruf、(1→2)连接的Fruf、(1→6)连接的Glcp以及(1,2→6)连接的Fruf。其中(2→6)连接的果糖占主导地位，证实果寡糖是主要成分。

质谱条件优化发现负离子模式在30 eV碰撞能量下能提供更高的响应强度、更丰富的碎片谱图，并增强可变连接低聚糖的表征能力。研究人员建立了基于特征碎片离子的低聚糖质谱裂解规律，发现(1→6)连接的葡萄糖产生[Hex-H-120]^-碎片；(1→2)连接的果糖可能产生[Hex-H-108]^-碎片或无碎片离子；(2→6)连接的果糖同时产生[Hex-H-108]^-和[Hex-H-120]^-碎片。

通过系统分析，研究人员成功鉴定了34种黄精低聚糖，所有化合物均呈现果糖和葡萄糖的单糖组成。结构骨架由通过(1→2)和(2→6)糖苷键连接的果糖残基组成，其中32种化合物为首次在黄精中报道。特别值得注意的是，研究人员发现黄精低聚糖中主要积累龙舌兰型果聚糖，其特征是通过内部葡萄糖残基形成(2→6)和(2→1)连接的分支结构。

在讨论部分，研究人员指出果聚糖作为水溶性植物低聚糖，是由果糖单元连接到蔗糖核心形成的。黄精物种独特地积累龙舌兰型果聚糖，其β-构型在果糖单元的C2位置赋予了对人体消化酶的抵抗力，使FOS具有益生元特性和代谢调节功能。黄精低聚糖可能通过调节肠道菌群组成和恢复短链脂肪酸平衡，为NAFLD干预机制提供新的见解。

该研究的创新之处在于首次将LC-MS/MS技术应用于系统表征黄精中的中性低聚糖，建立了基于质谱的低聚糖分析方法学。研究发现为开发黄精功能性食品提供了支持，不仅为理解其药食同特性的物质基础提供了新见解，也为中药材复杂碳水化合物成分的分析提供了方法学参考。

研究结论表明，该研究首次使用UPLC-Orbitrap-MS/MS系统表征了具有生物活性的PK-D1的结构。结合单糖分析和GC-MS的结果显示，PK-D1的骨架以果糖为主，具有(2→1)、(2→6)和(1,2→6)糖苷键形成分支结构。独特的环内裂解模式——特别是108和120 Da的中性丢失——为鉴定龙舌兰型果聚糖提供了证据。动物实验证明黄精低聚糖干预能显著降低脂肪肝模型小鼠血清ALT/AST水平。与以往以多糖为重点的研究不同，该工作确认黄精是一种新的FOS资源，并建立了基于特征裂解模式的质谱低聚糖分析方法，为中药复杂碳水化合物成分分析提供了方法学参考。