鱼类环境DNA宏条形码引物在河口生态系统的评估与应用：以珠江虎门河口为例

《Global Ecology and Conservation》：Evaluation and application of eDNA metabarcoding primers of fish: a case study in an estuarine ecosystem

本研究针对河口复杂生境中鱼类eDNA宏条形码引物选择缺乏系统性评估的问题，通过计算机模拟PCR、实地水样验证和模拟群落实验，系统评估了11对引物在珠江口虎门河口的适用性。研究发现MiFish-U引物组合最适合该区域鱼类多样性调查，并证实eDNA浓度与测序读数呈正相关，为河口生态系统生物多样性监测提供了关键技术支撑。

　　

河口生态系统作为淡水与海水的交汇区域，孕育着极其丰富的鱼类资源，同时也面临着人类活动的巨大压力。珠江口作为我国南部最大的河口生态系统，支撑着200多种鱼类生存，具有重要的生态和经济价值。然而，近年来由于过度捕捞、外来物种入侵、水文改变和污染等人类活动的协同压力，该区域的生物多样性出现了显著下降。传统的鱼类监测方法，如拖网捕捞和声学调查，在珠江口这样的动态环境中面临着诸多限制：浑浊水域和强潮汐带来的操作困难、对稀有和隐蔽物种的低灵敏度、对生态系统的高干扰性（特别是对像黄唇鱼这样的濒危物种），以及不足以跟踪快速环境变化的时空分辨率。

环境DNA（environmental DNA，eDNA）宏条形码（metabarcoding）技术作为一种新兴的监测手段，为河口生态系统监测提供了有前景的替代方案。该技术具有高灵敏度、非侵入性和成本效益等优势。然而，其有效性在很大程度上取决于适当的引物选择——这一挑战在河口环境中尤为突出。珠江口的鱼类组合包含系统发育差异较大的淡水定居种、海洋洄游种和溯河产卵种，要求引物具有异常广泛的分类覆盖范围，以最大限度地减少跨谱系的扩增偏差。此外，河口特有的显著盐度梯度通过影响DNA完整性、聚合酶活性和抑制剂效力来调节PCR效率，需要能够适应物理化学变化的引物。更重要的是，环境eDNA浓度与宏条形码读数之间的关系，是半定量群落分析的基础，极易受到引物诱导的扭曲。分类单元特异性引物结合效率差异可能扭曲相对丰度估计，这个问题在河口环境中因混合生物模板和异质抑制剂而加剧。

因此，针对珠江口虎门河口这一水文复杂区域（北江、西江、东江和流溪河在此汇合），研究人员开展了一项系统性的eDNA宏条形码引物评估研究。该区域也是一个生态敏感区，拥有极度濒危的黄唇鱼自然保护区，其生存与当地鱼类群落的完整性密切相关。这种动态环境以陡峭且波动的盐度梯度和系统发育不同的淡水及海洋生物组合的混合为特征，对eDNA宏条形码方法提出了独特的挑战。

为了应对在这种动态河口系统中监测生物多样性的技术挑战，研究团队实施了一个三层方法框架：首先利用计算机模拟PCR（in silico PCR）筛选候选宏条形码引物，随后使用珠江口水样进行实地验证，然后进行受控的模拟群落（mock community）实验以验证其分类分辨率并检验eDNA浓度与宏条形码读数之间的关系。最终，通过筛选最优引物对，进行了鱼类群落时空动态的综合分析。

本研究主要应用了环境DNA宏条形码技术、计算机模拟PCR分析、模拟群落实验、高通量测序以及生物信息学分析等关键技术方法。样本来源于珠江口虎门河口设置的30个采样点，在不同季节（春、夏、秋、冬）采集水样，并构建了包含9种代表性鱼类的模拟群落。

3. 结果

3.1. 引物筛选实验1：计算机模拟PCR

计算机模拟PCR用于引物筛选的结果显示，12S（MiFish-U/Tele02/Ac12S）和16S（Vert-16S）基因是最佳标记（91-99%的扩增率），而COI和cytb引物显示出极低的扩增率（<55%）。总之，针对12S和16S基因的高效引物（MiFish-U, Tele02, Ac12S, Vert-16S）被推荐作为珠江口物种鉴定和群落结构分析的主要工具。

3.2. 引物筛选实验2：水样测试

对珠江口水样环境DNA的初步PCR筛选显示，不同引物组之间的性能存在明显差异。MiFish-U引物在6月份所有五个站点（S1–S5）的样本中均能稳定扩增出鱼类特异性产物，在特异性和扩增效率方面均表现出优越性能。Ac12S和Vert-16S引物仅在一部分样本中产生可检测信号，而West-FishF1和Fish-CYTB则完全失败。阴性PCR对照中未观察到扩增。维恩图分析显示，与Ac12S和Vert-16S相比，MiFish-U在每个采样点检测到的物种数量显著更多。

3.3. 引物筛选实验3：模拟群落测试

在模拟群落检测中，MiFish-U和Ac12S显示出最高的检测覆盖率，除鳓鱼外均能恢复所有目标物种，并对高丰度物种显示出特别高的灵敏度。Vert-16S能可靠地检测几个中丰度物种，但未能恢复鲻鱼和鳓鱼。Tele02在模拟群落中表现最差，仅达到66.7%的检出率，并漏检了三个高丰度分类单元。线性回归分析 relating initial eDNA concentration to post-sequencing read abundance indicate a positive trend for all four primer sets, but with markedly different strength and reliability. Vert-16S exhibited the highest goodness-of-fit (R2 = 0.89, p < 0.001). MiFish-U showed a moderate yet statistically significant fit (R2 = 0.71, p = 0.004), supporting its use for semi-quantitative interpretation of relative abundances under controlled conditions.

3.4. 宏条形码结果和鱼类群落组成

经过生物信息学过滤后，成功从为珠江虎门河口构建的MiFish-U引物文库中获得了68个测序样本。高通量测序这些样本产生的初始宏条形码读数范围从6,385到200,806，平均每个样本49,556个读数。数据清洗后，有效的鱼类读数范围从3,752到116,897，平均每个样本35,255个读数。这项eDNA调查鉴定出71种鱼类，属于36科18目。物种累积曲线表明，春季和夏季的30个采样点达到了稳定平台期，表明采样力度足以代表当地鱼类群落组成。

3.5. 珠江虎门河口鱼类多样性的时空变化

对鱼类群落生物量季节性变化的分析揭示了季节间群落结构的显著差异。香农-维纳指数在春季和夏季显著高于秋季。此外，辛普森多样性指数显示出与香农-维纳指数相同的模式。随后在秋季显著下降，并在冬季再次增加。相比之下，Chao1指数在不同季节间显示出与香农-维纳指数和辛普森指数相似的趋势；然而，这些季节性变化未达到统计学显著性。同样，Pielou均匀度指数在所有四个季节保持相对恒定，未观察到显著的季节性差异。

基于2024年6月测量的盐度梯度的空间格局，研究了群落组成空间结构沿此环境梯度的季节性变化。为此，比较了春季和夏季两个代表性季节中不同盐度组之间主坐标分析和Adonis检验的结果。在春季，PCoA1解释了总变异的17.23%，PCoA2解释了11.31%，共同捕获了样本间群落组成的差异。Adonis分析表明，在此空间尺度上，组间群落组成存在差异，分组解释了约8.6%的变异。在夏季，与春季相比，组间分离趋势较弱，Adonis分析显示，在当前显著性阈值下，组间群落组成差异无统计学意义。总之，主坐标分析结果揭示了A组和B组之间群落组成分离的季节性模式：春季组间差异显著但幅度较小，而夏季未观察到此类差异，反映了研究尺度上群落组成差异的季节性变化。

4. 讨论

本研究比较了计算机模拟PCR预测与宏条形码实验结果，揭示了计算模拟与环境样本检测之间的关联性和局限性。计算机模拟PCR作为一种基于序列匹配的引物筛选工具，其核心假设是引物-模板结合效率仅取决于序列互补性。虽然计算机模拟PCR已成为eDNA研究中成熟的方法，但我们对线粒体基因靶向引物的系统评估揭示了其关键局限性。针对COI和cytb基因设计的引物表现出特别差的性能，在参考数据库中的模拟扩增率持续低于50%。这一计算预测随后得到了实验验证，因为这些引物完全未能从实际水样中扩增出鱼类eDNA。

尽管12S和16S基因的引物显示出高的计算机模拟扩增率，但它们在