丹参碳点通过BrSPL11.1介导的抗坏血酸合成与循环通路增强菜心高低温胁迫耐受性

《Horticultural Plant Journal》：Salvia miltiorrhiza-derived carbon dots enhance heat and cold stress tolerance through BrSPL11.1-mediated ascorbic acid biosynthesis and recycling pathways in flowering Chinese cabbage

本研究针对全球气候变化加剧导致的高温(HT)与低温(LT)胁迫严重威胁蔬菜生产的难题，系统解析了丹参来源碳点(SmCDs)通过调控转录因子BrSPL11.1介导的抗坏血酸(AsA)合成与循环通路(BrGalDH/BrAPX/BrDHAR1)，增强菜心双温胁迫耐受性的分子机制。研究发现SmCDs通过抑制负向调控因子BrSPL11.1的转录活性，解除其对下游抗氧化基因的抑制作用，显著提升AsA含量并降低活性氧(ROS)积累，为纳米材料增强作物抗逆性提供了新策略。

　　

随着全球气候变化的加剧，极端温度事件（如热浪和寒潮）日益频繁，对自然生态系统和农业生产构成了严重威胁。当环境温度超过或低于作物生长的临界阈值时，植物的生长发育会受到抑制，导致作物产量和品质下降。菜心作为一种喜冷凉的蔬菜作物，在高温和低温胁迫下维持其感官品质和产量稳定性面临持续挑战。因此，探索增强作物高低温耐受性的新方法和新机制，对于保障蔬菜稳定供应具有重要意义。

近年来，纳米材料因其高效的植物吸收性、环境相容性以及独特的光学/化学功能，已成为增强植物非生物胁迫耐受性的有前景的工具。碳点（CDs）作为一种新型碳基纳米材料，具有纳米级尺寸、生物相容性、光致发光、抗氧化特性、安全性和环境友好性等特点，使其在植物抗氧化和胁迫缓解应用中具有巨大潜力。先前研究表明，丹参来源的碳点（SmCDs）能够增强意大利生菜的耐热性，并延缓菜心的衰老。然而，关于CDs如何通过精确的分子调控机制使植物同时应对高低温胁迫的研究仍然有限。

植物在温度胁迫下会激活活性氧（ROS）清除途径，从而减轻氧化损伤。ROS，包括超氧阴离子（O₂^?）和过氧化氢（H₂O₂），是植物响应生物和非生物胁迫的关键信号分子。植物利用酶促和非酶促抗氧化系统来抵消ROS的过度积累。抗坏血酸（AsA）作为抗坏血酸过氧化物酶（APX）的底物，在AsA生物合成和AsA-谷胱甘肽（GSH）循环中扮演核心角色，将ROS代谢与非生物胁迫耐受性和细胞氧化还原稳态联系起来。尽管已有研究揭示了AsA在植物抗逆中的重要作用，以及某些转录因子如SPL（Squamosa启动子结合蛋白类似物）家族成员参与温度胁迫响应，但SPL转录因子如何与AsA生物合成及循环通路基因相互作用，从而协同调控植物对高低温胁迫的耐受性，其分子机制尚不明确。

为了回答上述问题，研究人员在《Horticultural Plant Journal》上发表了题为“Salvia miltiorrhiza-derived carbon dots enhance heat and cold stress tolerance through BrSPL11.1-mediated ascorbic acid biosynthesis and recycling pathways in flowering Chinese cabbage”的研究论文。该研究旨在阐明BrSPL11.1转录因子以及关键AsA生物合成和循环通路基因（BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH）在SmCDs处理下调控菜心高低温耐受性的功能。研究结果证实，BrSPL11.1作为高低温耐受性的负调控因子，通过直接结合BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH的启动子抑制其转录，而SmCDs则通过抑制BrSPL11.1的转录来增强植物的胁迫耐受性。这项研究揭示了SmCDs通过BrSPL介导的AsA生物合成和循环通路增强菜心高低温胁迫耐受性的分子调控机制，为通过整合SmCDs应用和品种开发来放大菜心极端温度耐受性奠定了理论基础。

本研究综合运用了生物信息学分析、基因家族鉴定与系统进化分析、定量逆转录PCR（qRT-PCR）、亚细胞定位、转基因植物构建（过表达和CRISPR/Cas9基因编辑）、酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告基因（LUC）检测、β-葡萄糖醛酸酶（GUS）染色、电泳迁移率变动分析（EMSA）、病毒诱导的基因沉默（VIGS）以及生理生化指标（如抗氧化酶活性、ROS含量、AsA-GSH循环指标）测定等多种关键技术方法。研究材料主要为菜心以及模式植物拟南芥和本氏烟草。

3.1. 菜心BrSPL基因家族的分子特征

研究人员通过生物信息学分析，在菜心中鉴定出29个具有完全保守SBP结构域的BrSPL家族成员。基因结构、保守基序和染色体定位分析显示了该家族的多样性。理化性质预测表明大多数BrSPL蛋白定位于细胞核。这些分析为了解BrSPL基因的基本特征和潜在功能奠定了基础。

3.2. BrSPL基因家族的扩张与系统进化

通过比较基因组学分析，发现菜心与拟南芥之间存在37对共线性基因对，反映了Brassica基因组特有的三倍化事件。非同义替换率（Ka）与同义替换率（Ks）之比（Ka/Ks）分析表明所有BrSPL基因均受到纯化选择。系统进化树将SPL家族初步分为5个组，其中BrSPL11.1与拟南芥AtSPL11亲缘关系较近，提示功能可能保守。

3.3. SmCDs缓解高低温胁迫及关键BrSPLs的鉴定

表型观察发现SmCDs处理能显著减轻高低温胁迫引起的菜心叶片坏死和失绿现象。通过qRT-PCR分析29个BrSPL成员在高低温及SmCDs处理下的表达模式，发现BrSPL11.1的表达同时被高低温胁迫下调，并被SmCDs进一步抑制，表明其可能作为负调控因子响应双温胁迫。

3.4. BrSPL11.1定位于细胞核并作为转录抑制子

亚细胞定位实验证实BrSPL11.1蛋白定位于细胞核。酵母转录自激活和双荧光素酶报告基因实验均证明BrSPL11.1不具有转录自激活活性，反而表现为转录抑制子。

3.5. BrSPL11.1负调控耐热性但被SmCDs抑制

通过构建BrSPL11.1过表达拟南芥植株和其同源基因AtSPL11.1的CRISPR/Cas9敲除突变体，进行耐热性分析。结果显示，过表达植株对热胁迫更敏感，存活率降低；而敲除突变体则表现出增强的耐热性。SmCDs处理能显著提高过表达植株在热胁迫下的存活率，并抑制BrSPL11.1的转录水平。证明BrSPL11.1负调控耐热性，且其功能可被SmCDs抑制。

3.6. BrSPL11.1负调控耐冷性但被SmCDs抑制

类似地，在低温胁迫下，BrSPL11.1过表达植株表现出冷敏感表型，存活率降低；而Atspl11.1突变体则耐冷性增强。SmCDs处理同样能缓解过表达植株的冷胁迫损伤，提高存活率，并抑制BrSPL11.1的表达。表明BrSPL11.1也负调控耐冷性，且SmCDs能通过调控BrSPL11.1来增强植物的耐冷性。

3.7. SmCDs通过抑制BrSPL11.1介导的ROS产生来提高高低温胁迫耐受性

通过DAB和NBT染色检测H₂O₂和O₂^?积累，发现BrSPL11.1过表达加剧了高低温胁迫下的ROS积累，而突变体和SmCDs处理的过表达植株ROS积累较少。生理指标测定表明，过表达植株的SOD、POD、CAT抗氧化酶活性降低，H₂O₂、O₂^?和MDA含量升高；突变体则相反。SmCDs处理能部分逆转过表达植株的不利生理状态。证明BrSPL11.1通过抑制抗氧化酶活性加剧ROS积累和膜脂过氧化，而SmCDs能缓解这种损害。

3.8. AsA生物合成和循环通路参与SmCD介导的BrSPL11.1积累以调控高低温胁迫耐受性

研究发现高低温胁迫均能诱导菜心中16个AsA生物合成和循环通路相关基因的表达上调，并促进AsA积累。SmCDs能同时上调BrGaIDH、BrAPX和BrDHAR1在高低温胁迫下的表达。在拟南芥转基因植株中，过表达BrSPL11.1导致AsA、DHA、GSSG、GSH含量以及APX、DHAR活性降低，而突变体和SmCDs处理的过表达植株则相反。表达热图显示AtGalDH、AtAPX和AtDHAR1的表达在过表达植株中被抑制，在突变体和SmCDs处理植株中被促进。证实BrGalDH、BrAPX和BrDHAR1是BrSPL11.1介导的、受SmCDs调控的响应高低温胁迫的关键基因。

3.9. BrSPL11.1结合BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH的启动子并抑制其表达

通过生物信息学预测发现BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH的启动子区域存在多个BrSPL11.1可能的结合位点。酵母单杂交实验证实了BrSPL11.1与这三个基因启动子的直接结合。双荧光素酶报告基因实验表明，BrSPL11.1能显著抑制报告基因的活性，且这种抑制在高低温胁迫下更为明显，而SmCDs处理能减轻这种抑制。GUS染色实验进一步验证了BrSPL11.1对下游靶基因启动子活性的抑制作用以及SmCDs的缓解效应。EMSA实验最终在蛋白水平证实了BrSPL11.1通过GTAC核心基序直接结合到这三个靶基因的启动子区域。这些结果综合证明了BrSPL11.1作为转录抑制子直接负调控BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH的转录。

3.10. BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH促进高低温胁迫耐受性并受SmCDs调控

利用病毒诱导的基因沉默技术分别沉默菜心中的BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH基因。表型观察发现，基因沉默植株在高低温胁迫下表现出更严重的叶片萎蔫和组织损伤，ROS积累增加，而SmCDs处理能减轻这些损伤。ASA和DHA含量测定表明，基因沉默植株的抗氧化物质含量显著降低，SmCDs处理则能提高其含量。基因表达分析显示SmCDs能增强这三个基因在胁迫下的表达。证明BrAPX、BrDHAR1和BrGalDH通过促进抗氧化物质积累在提高菜心高低温抗性中起重要作用，且SmCDs能强化这种作用。

本研究首次系统鉴定了菜心BrSPL基因家族，并揭示了BrSPL11.1作为双温胁迫负调控因子的新颖功能。研究结论表明，SmCDs作为一种绿色纳米材料，能够通过抑制转录抑制因子BrSPL11.1的活性，解除其对下游关键抗氧化基因（BrGalDH、BrAPX和BrDHAR1）的转录抑制，从而激活AsA生物合成与循环通路，显著提升植物体内的AsA和DHA含量，有效清除过量ROS，维持细胞氧化还原稳态，最终协同增强菜心对高低温胁迫的耐受性。该研究不仅阐明了SPL转录因子调控植物温度适应性的新机制，而且为纳米材料在农业抗逆生产中的应用提供了理论依据和实践策略。理解SmCDs协同增强高低温耐受性的分子机制，为分子育种提供了SmCDs响应的遗传资源，这些资源可赋予作物双胁迫耐受性，并为通过整合SmCDs应用和品种开发来增强菜心极端温度耐受性奠定了理论基础。由于SmCDs源自药食同源植物丹参且采用绿色合成方法，其在农作物上的应用具有较高的安全性，在可持续农业发展中展现出广阔的应用前景。