PbrDGK3调控梨花粉管内膜区室稳态的作用机制研究

《Horticultural Plant Journal》：PbrDGK3 participates in the homeostasis of endomembrane compartments in pollen tubes in pear

本研究针对梨花粉管生长过程中内膜区室稳态调控机制不清的问题，通过抑制DGK活性和基因表达，发现PbrDGK3通过维持内膜系统稳定性保障花粉萌发与花粉管生长。该成果首次揭示DGK3在花粉管内膜稳态中的主导作用，为植物生殖发育调控提供了新视角。

　　

在梨树生产中，保证正常结果是关键环节，而花粉萌发和花粉管生长直接影响授粉成功率。二酰甘油激酶(DGK)作为磷脂酸(PA)合成关键酶，其家族成员在梨花粉管生长中的功能尚不明确。前期研究发现PbrDGK4参与液泡形态调控，但其他成员的作用机制仍是未解之谜。尤其内膜区室（包括内质网、高尔基体、液泡等）作为物质合成与运输枢纽，其稳态维持对花粉管极性生长至关重要，相关调控机制亟待揭示。

为探究这一问题，研究人员以‘砀山酥梨’花粉为材料，通过DGK特异性抑制剂R59-022处理发现，长期抑制DGK活性会导致花粉内膜区室紊乱并完全丧失萌发能力，同时伴随花粉管生长停滞。利用FM1-43荧光探针标记证实，异常花粉管内膜系统无法被标记，但内部胞质环流仍存在。通过RT-PCR分析发现，PbrDGK3在花粉管中特异性高表达且稳定性强，其表达模式与花粉萌发进程正相关。

关键技术方法包括：基于‘砀山酥梨’花粉样本的离体培养体系、DGK活性抑制剂R59-022处理、反义寡核苷酸(as-ODN)基因沉默技术、激光共聚焦显微镜亚细胞定位观察、粒子轰击介导的瞬时表达系统以及系统发育分析。

3.1 DGK活性缺失抑制花粉萌发与生长并破坏内膜区室稳态

抑制剂实验表明，50 μmol·L^-1 R59-022处理2小时使花粉萌发率趋近于零，且43%花粉出现内膜区室紊乱。恢复实验证实，短期抑制（1小时）可逆，而长期抑制导致不可逆萌发能力丧失。在生长中的花粉管中，DGK活性抑制同样引发内膜区室紊乱与生长停滞，且异常区域无法被FM1-43标记。

3.2 DGK表达与花粉萌发及生长相关

组织特异性表达分析显示，PbrDGK3在花粉管中表达显著高于其他组织，且其在花粉萌发过程中持续高表达。与高表达的PbrDGK4/6相比，PbrDGK3表达量较低但稳定性突出，暗示其可能发挥基础调控作用。

3.3 PbrDGK3参与维持花粉管内膜区室稳态

通过as-ODN沉默技术发现，抑制PbrDGK1/2/3均会导致内膜区室紊乱，其中PbrDGK3沉默效果最显著（异常率达28%），且三者同时沉默时表型加剧，表明功能冗余。其他DGK成员未参与该过程，凸显PbrDGK3的核心地位。

3.4 PbrDGK3定位于花粉内膜区室

系统发育分析显示PbrDGK1/2/3属于Cluster 1家族，具有两个C1结构域和跨膜区。粒子轰击定位实验发现，PbrDGK3在花粉粒中富集于膜系统，萌发后向花粉管运输，并在成熟花粉管中分布于除顶端外的全域内膜区室。其沿胞质环流双向运输的特性（速率约0.3 μm/s）可能为维持膜稳态的关键。

讨论部分指出，DGK家族不同成员定位差异显著：Cluster 2/3成员多定位于质膜或细胞质，而Cluster 1成员（如PbrDGK3）保守定位于内膜系统，这可能与其C1结构域和跨膜区相关。本研究首次揭示Cluster 1成员通过维持PA稳态调控内膜区室平衡的新机制。推测PbrDGK3可能通过调节PA含量影响膜脂物理性质，进而调控膜融合与重塑过程。该发现为园艺作物生殖发育调控提供了新靶点，对提高作物授粉效率具有潜在应用价值。

结论明确PbrDGK3作为内膜区室稳态的关键调节因子，其独特的定位与运输模式为花粉萌发与花粉管生长提供了必要的膜环境保障。该研究发表于《Horticultural Plant Journal》，为植物膜生物学与生殖生理学交叉研究提供了重要案例。