苹果'惠'自交后代近交衰退解析及果实大小关键基因MdCYP714C功能鉴定

《Horticultural Plant Journal》：Inbreeding depression and functional analysis of major genes in the F 1-selfed progeny of the apple ‘Megumi’

本研究针对苹果自交不亲和性导致纯合系选育困难及近交衰退机制不明的瓶颈，以自交亲和品种'惠'（'Megumi'）的自交F1代及其与'长富2号'（'Nagafu2'）的杂交后代为材料，系统评估了近交衰退程度。研究发现自交后代在果实大小、重量及可溶性固形物含量上存在显著衰退，并通过BSA定位到染色体14上控制果实大小的QTL，进而鉴定出果实特异性表达基因MdCYP714C。功能验证表明该基因通过调控细胞生长影响果实发育，其表达下调与自交导致的杂合度降低相关。该研究揭示了苹果近交衰退的关键遗传机制，为自交不亲和果树纯合系育种提供了新见解。

　　

在果树育种领域，有一个令人着迷又头疼的悖论：杂交能够产生具有杂种优势的后代，但想要获得遗传稳定的优良品种，又需要培育纯合的自交系。然而，对于苹果这类典型的自交不亲和（Self-Incompatible, SI）物种来说，这条路几乎被堵死了。自交不亲和机制如同一道天然的屏障，阻止了苹果进行自花授粉，使得其基因组长期保持着高度的杂合性。这种杂合性虽然是物种适应和进化的优势，却也给育种家带来了巨大挑战——他们难以像处理水稻、玉米那样，通过多代自交来获得纯合系，从而无法充分利用纯合系杂交所能带来的最大杂种优势。更令人担忧的是，如果强行进行自交，后代往往会出现“近交衰退”（Inbreeding Depression, ID），表现为生长势减弱、产量下降、果实品质变劣等一系列问题。那么，在苹果中，近交衰退究竟有多严重？其背后的遗传机制是什么？能否找到突破口，为苹果乃至其他自交不亲和果树的纯合系育种开辟一条新路？这些正是中国农业大学果树细胞与分子育种实验室的研究团队试图解答的核心科学问题。

幸运的是，研究人员在苹果资源库中发现了一个罕见的“宝贝”——品种‘惠’（'Megumi'）。与绝大多数苹果品种不同，‘惠’表现出显著的自交亲和性（Self-Compatible, SC），这意味着它能够成功地自花授粉并产生后代。这一特性为研究苹果的近交衰退现象和尝试创建纯合系提供了绝佳的材料。研究人员以此为基础，设计了一项精巧的实验：他们不仅获得了‘惠’的自交F₁代群体，还通过‘惠’与‘长富2号’（'Nagafu2'）的正反杂交（‘惠’ × ‘长富2号’和‘长富2号’ × ‘惠’），创建了杂交对照组。通过系统比较自交后代与杂交后代在生长、叶片和果实性状上的差异，他们能够精确量化近交衰退的程度，并深入挖掘其遗传根源。这项研究成果正式发表在园艺学领域知名期刊《Horticultural Plant Journal》上。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了几项关键的技术方法。首先是经典的田间性状调查与统计分析方法，对来自三个群体（自交组、正交组、反交组）的植株进行了连续两年的生长（树高、冠幅）和果实性状（单果重、纵横径、可溶性固形物等）测量，并计算了近交衰退系数。其次，他们采用了基于极端性状混池（Bulked Segregant Analysis, BSA）的重测序技术，通过对自交后代中果实极大和极小个体分别混池进行基因组测序，定位与果实大小相关的数量性状位点（Quantitative Trait Locus, QTL）。再者，利用实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析了候选基因在不同组织、不同发育时期以及不同大小果实中的表达模式。最后，通过农杆菌介导的遗传转化技术，在苹果愈伤组织体系中进行了候选基因的过表达和基因编辑（CRISPR/Cas9）功能验证，并结合显微观察技术分析了基因功能改变对细胞形态的影响。所有实验均设置了生物学重复，以确保结果的可靠性。

3.1 ‘惠’自交后代的表型变异与近交衰退

研究结果清晰地表明，‘惠’的自交F₁代确实出现了明显的近交衰退现象。在生长性状上，自交后代与杂交后代在树高和冠幅上没有显著差异，但自交后代冠幅的变异系数（Coefficient of Variation, CV）比杂交后代高了约20%，暗示了其遗传背景趋于复杂和不稳定。在叶片形态上，自交后代的叶片宽度显著变窄（约10%），叶形指数（Leaf Shape Index, LSI）增大，即叶片变得更加狭长，并且其叶长、叶宽、叶形指数和叶柄长度的变异系数均高于杂交后代。最触目惊心的衰退体现在果实上。自交后代的果实横径和纵径分别比杂交后代减少了约17%和20%，平均单果重仅为98克，比正、反交后代分别下降了49%和60%。此外，自交后代果实的可溶性固形物（Soluble Solids, SS）含量也显著降低。所有这些受近交衰退影响的性状，在自交后代群体内部的变异程度（即CV值）都更大，尤其是单果重的变异系数增加了约35%。这些数据强有力地证明，在‘惠’苹果的自交F₁代中，近交衰退是真实存在且相当严重的。

3.2 果实大小是‘惠’苹果近交衰退的关键性状

为了确定哪些性状是区分自交和杂交群体的最关键指标，研究人员采用了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和随机森林（Random Forest）两种多元统计方法。结果高度一致地指出，单果重、果实纵径、果实横径和可溶性固形物含量是VIP值（Variable Importance in Projection）最高或平均精度下降（Mean Decrease in Accuracy）最大的性状。其中，单果重的近交衰退系数最高，相对于正、反交对照组，其衰退幅度分别达到了32.83%和37.41%。相关性分析进一步显示，单果重与果实纵横径呈极显著正相关，与可溶性固形物含量也呈中等程度正相关。这表明，近交衰退导致的果实变小，可能也连带影响了果实的糖分积累等品质性状。因此，果实大小（尤其是单果重）被确定为‘惠’苹果近交衰退最核心的表型。

3.3 MdCYP714C是导致‘惠’自交后代果实变小的关键基因

那么，是哪个基因在幕后主导着果实大小的衰退呢？研究人员对自交后代中果实极大（>150克）和极小（<50克）的个体分别混池，进行了BSA分析。结果在14号染色体上发现了一个与果实重量相关的显著QTL峰值。在该QTL区间内，小果池的杂合度比大果池低了约20%，说明自交导致的该区域纯合度增加可能与性状衰退有关。对该区间内基因的筛选发现，一个名为MD14G1091100的基因在果肉中特异性高表达。该基因与水稻中的OsCYP714C2亚家族同源，因此被命名为MdCYP714C。系统进化分析和亚细胞定位提示它可能编码一个定位于细胞膜的细胞色素P450酶，参与活性赤霉素（Gibberellin, GA）的生物合成。表达分析显示，MdCYP714C在大果后代中的表达量比小果后代高139%，并且其表达量随着果实发育成熟而逐渐增加。

为了验证MdCYP714C的功能，研究人员通过转基因技术获得了该基因的过表达和基因敲除苹果愈伤组织系。显微镜观察发现，与野生型（Wild Type, WT）相比，过表达MdCYP714C的愈伤组织细胞长度和宽度显著增加，而敲除该基因则导致细胞长度变短、宽度增加，细胞形状发生改变。这直接证明了MdCYP714C具有促进苹果细胞生长的功能。更重要的是，与‘惠’ב长富2号’和‘长富2号’ב惠’的杂交后代相比，‘惠’自交F₁代果实中MdCYP714C的表达量下降了约22.7%。对MdCYP714C基因启动子和编码区的SNP分析发现，小果后代的杂合位点比例低于大果后代。这些证据串联起来，形成了一个完整的逻辑链：自交导致MdCYP714C基因座位的杂合度降低，进而引起该基因表达水平下降，最终通过抑制细胞生长导致果实变小。MdCYP714C因此被确认为介导苹果果实大小近交衰退的一个关键基因。

综合讨论与结论部分，本研究首次在苹果中利用自交亲和品种‘惠’，系统量化了其自交F₁代的近交衰退，并成功定位和功能验证了一个关键基因MdCYP714C。近交衰退的程度因物种和性状而异。与一些一年生作物不同，本研究发现苹果的自交后代在营养生长方面衰退不显著，但繁殖器官（果实）相关性状衰退极为严重，这可能与苹果作为长期异花授粉的多年生木本果树，其基因组中隐藏了大量与繁殖适应性相关的隐性有害等位基因有关。一旦自交，这些隐性有害基因纯合，便对果实发育造成巨大冲击。

MdCYP714C的发现为理解近交衰退的分子机制提供了具体案例。其表达下调与局部基因组区域杂合度降低的关联，提示了近交衰退可能源于“超显性”效应（即杂合子优于纯合子）的丧失。近期在玉米中的研究表明，近交可引起特定基因组区域（如TCP转录因子结合位点）的CHH型超甲基化，导致染色质可及性降低和基因表达抑制。本研究推测，苹果自交导致的基因组纯合化可能也引发了类似的表观遗传修饰变化，从而抑制了MdCYP714C等重要基因的表达，这为未来深入探索指明了方向。

这项研究的结论具有重要的理论和实践意义。在理论上，它揭示了自交不亲和果树近交衰退的特定模式，并阐明了一个由细胞色素P450基因MdCYP714C介导的、影响果实大小的关键机制。在实践上，一方面，鉴定出的MdCYP714C基因具有应用于分子标记辅助选择（MAS）或基因工程育种以改良果实大小的潜力；另一方面，对‘惠’这类自交亲和种质的发掘和利用，为打破苹果自交不亲和障碍、开展纯合系创制提供了宝贵的起始材料。尽管纯合系育种道路漫长且充满挑战（需要克服多代自交带来的严重衰退），但本研究迈出了关键的第一步。未来的育种策略可以着眼于通过基因组设计，逐步固定具有正向加性效应的优良等位基因，最终实现高效选育优良苹果自交系，为充分利用杂种优势、培育突破性苹果新品种奠定坚实基础。