全基因组测序揭示年轻结肠腺瘤患者非编码区致病突变的研究价值

《Frontiers in Oncology》：The use of whole genome sequencing to study young patients with 100+ adenomas of the colon

本研究探讨了全基因组测序（WGS）在年轻（15-45岁）且结肠腺瘤数量超过100个的患者中的应用价值。通过WGS技术，研究人员在常规分子检测方法（如Sanger测序、MLPA或多基因NGS panel）未能发现致病突变的情况下，成功识别出位于APC和BMPR1A基因非编码区的致病性或可能致病性胚系变异。研究结果凸显了WGS在提升腺瘤性息肉病综合征（APS）遗传诊断率方面的重要作用，为临床精准医疗提供了新策略。

　　

Objective

腺瘤性息肉病综合征（APS）是一种罕见的遗传性疾病，其特征是结肠出现多个（超过20个）腺瘤，若不进行手术治疗，其恶性转化风险极高。该病最侵袭性的形式表现为患者在45岁前出现超过100个息肉，主要由APC基因的胚系致病性变异引起，但也有报道称患者携带MUTYH基因以及极少数情况下SMAD4和BMPR1A基因的胚系变异。常规分子检测方法，如Sanger测序、多重连接依赖性探针扩增（MLPA）或多基因下一代测序（NGS） panel，可能无法检测到非编码区域的致病性变异。

Patients and methods

研究纳入了10名患者（APS发病年龄在15至45岁之间），这些患者通过内镜检查被确认结肠腺瘤性息肉数量超过100个。研究人员对来自血液样本的DNA进行了全基因组测序（WGS）。先前的基因检测未在这些患者中发现APC和MUTYH编码外显子中存在任何胚系致病性变异。

Results

WGS在3名患者中鉴定出位于基因非编码区的致病性或可能致病性胚系变异。两名无关患者均在APC基因的1B启动子区携带相同的c.-190G>A（rs879253785）变异（NM_001127511.3），而第三名患者则在BMPR1A基因中携带c.-152-2A>G变异（NM_004329.3）。使用标准的NGS panel或全外显子组测序（WES）将无法检测到这些变异。

Introduction

家族性腺瘤性息肉病（FAP）（OMIM # 175100）是腺瘤性息肉病综合征中最常见的形式，是一种遗传性综合征，其特征是结肠出现数十至数百（甚至数千）个息肉，除非早期发现并手术切除，否则具有极高的结直肠癌风险。FAP的发病率介于1/5000至1/18000之间。该病分为衰减型（患者年龄大于45岁，息肉少于100个）或经典型（患者年龄小于45岁，息肉超过100个），后者更为普遍。

两种形式的FAP主要由APC基因（OMIM # 611731）的致病性或可能致病性变异引起。该基因编码一种参与WNT信号通路的蛋白。根据各国正在进行的研究，在息肉超过100个的患者中，遗传性APC变异的检出率为70-90%。检测致病性APC变异至关重要，因为它可以确认经典FAP的诊断，这是进行扩大外科手术干预（即直肠结肠切除术）的指征。

除了APC变异外，腺瘤性息肉病综合征也可由MUTYH基因（OMIM # 604933）的双等位基因变异引起。这些患者通常被诊断出约有50个结肠息肉，但有些患者可能发展为超过100个息肉。极少数情况下，BMPR1A（OMIM # 601299）和SMAD4基因（OMIM # 600993）的突变也可导致该疾病的发生。这些基因中的大多数致病性和可能致病性杂合变异会导致幼年性息肉病综合征（JPS）。然而，一些JPS患者同时表现出幼年性息肉和腺瘤性息肉。此外，一些作者报道了仅被诊断为腺瘤性增生的BMPR1A和SMAD4突变患者。

本研究描述了十名俄罗斯患者的WGS检测结果，这些患者结肠腺瘤性息肉超过100个，且通过常规DNA检测方法（Sanger测序和MLPA）未发现致病性变异。

Patients and methods

入组研究的患者包括6名男性和4名女性（FAP发病年龄在15至45岁之间），他们在2020年3月至2023年9月期间于俄罗斯联邦卫生部Ryzhikh国家结肠直肠病医学研究中心（RNMRCC）接受治疗或观察。入组前对患者血液样本DNA进行的基因检测（通过Sanger测序和MLPA）未发现任何APC和MUTYH的致病性或可能致病性变异。所有入组患者均签署了知情同意书，该研究符合《赫尔辛基宣言》的伦理原则，并获得了RNMRCC伦理委员会的批准。

Whole genome sequencing, annotation and interpretation

使用基于磁珠的吸附法（MGIEasy Magnetic Beads Blood Genomic DNA Extraction Kit, MGI）提取基因组DNA，随后用于制备测序文库。文库制备采用无PCR方案，使用酶促DNA片段化（MGIEasy FS PCR-Free Library Prep Set, MGI）。制备好的文库在DNBSEQ-T7测序仪（PE150）上进行测序，目标中位覆盖度为30×。测序读数使用cutadapt 4.2进行接头去除（MGIEasy DNA Adapters）和低质量读段末端修剪。使用bwa 0.7.17将读段比对至GDC参考基因组GRCh38.d1.vd1。使用Picard 2.27.5进行重复标记。使用DeepVariant 1.4进行短变异检测。

变异注释使用Ensembl Variant Predictor（VEP）完成，包括来自ClinVar 20240603和gnomAD v.4.1数据库的信息。使用SpliceAI和Pangolin评估变异对剪接位点的影响。使用PolyPhen-2、CADD v.1.7和AlphaMissense评估新发现的错义变异的致病性。检测到的变异的临床意义解读依据ACMG指南进行。

具有临床意义的变异通过Sanger测序（ABI PRISM 3500 genetic analyzer）进行确认。

Results

对10名结肠腺瘤性息肉超过100个的患者DNA样本进行WGS，在3例病例中发现了致病性或可能致病性变异。在所有3例病例中，发现均通过Sanger测序得到确认。

两名无关患者在APC基因的1B启动子区的YY1结合基序中携带c.-190G>A（rs879253785）变异（NM_001127511.3）。Li等人（2016）的研究表明，该变异通过干扰转录因子YY1的结合，降低了从1B启动子的转录。作者进行了分离分析，发现该变异存在于三代中的5名患病亲属中，但未出现在健康家庭成员中。

第一名携带APC基因变异的患者为30岁女性，拥有超过1000个大小在0.2至1.0厘米之间的结肠腺瘤性息肉，这是进行 restorative proctocolectomy 的指征。术后病理检查显示无恶性病变。据家族史，她的母亲在33岁时因乙状结肠癌伴播散去世，而她的外祖母在45岁时因结肠癌去世。

第二名携带APC基因变异的患者，41岁，同样有超过1000个大小在0.1至0.4厘米之间的腺瘤性息肉，并患有直肠癌 pT1N0M0，接受了 restorative proctocolectomy。由于患者是孤儿，疾病家族史未知。

在第三名患者，一名24岁女性中，WGS意外检测到BMPR1A基因（NM_004329.3）的c.-152-2A>G变异。该变异在gnomAD中无报道的人群频率（0/152,316等位基因）。该替换影响了典型的剪接受体位点，是该基因中的一个功能丧失性变异，而功能丧失是该基因已知的致病机制。根据ACMG建议，该变异被归类为可能致病性（符合PVS1、PM2标准）。据我们所知，该变异仅被报道过一次，Staninova-Stojovska等人（2019）在一名患有超过100个幼年性息肉的患者中将其描述为致病性。根据病史，该患者从15岁起接受了多次结肠息肉切除术。多年来，她发展出超过100个息肉，最大尺寸达2.5厘米。她也接受了 restorative proctocolectomy。术后病理检查显示无恶性病变，所有检查的息肉均为腺瘤。她的父母均健在且健康。

Discussion

在之前的工作中，108名疑似FAP患者队列中APC基因致病性变异的频率达到72.2%。在该研究中，APC编码外显子的基因检测主要使用构象敏感凝胶电泳（CSGE）进行，Sanger测序仅针对迁移率改变的DNA片段进行。根据Kerr等人的研究，他们同样采用了多种方法，在1591名疑似FAP患者中致病性和可能致病性APC变异的频率仅为27%。虽然CSGE能够成功检测小的插入和缺失，但偶尔无法识别单核苷酸变异。这促使我们开始将对所有APC编码外显子进行Sanger测序作为疑似FAP患者的常规基因检测方法。我们还使用MLPA来搜索无点突变患者中的大片段APC缺失或重复。这两种方法的结合使我们经典FAP患者中致病性（或可能致病性）APC变异的检出率提高至91.6%。

由于转向结合Sanger测序和MLPA仍未能确定所有病例的遗传病因，我们在此评估了使用WGS来进一步提高诊断效率。对10例Sanger/MLPA组合结果为阴性的FAP病例进行WGS分析，在两名患者中识别出先前描述的APC基因c.-190G>A变异，并在一名患者中识别出极为罕见的BMPR1A基因可能致病性变异c.-152-2A>G。总体而言，纳入WGS使得临床诊断为经典FAP的患者中已识别变异的总发生率提高至94%以上。

在APC基因1B启动子区检测到的c.-190G>A（rs879253785）变异，位于距离该基因第二个外显子中第一个编码核苷酸47,363 bp的位置。因此，目前任何标准NGS panel都无法检测到它。

BMPR1A基因c.-152-2A>G变异的情况更为复杂。它仅位于该基因第3外显子前两个核苷酸的位置，但到第一个编码核苷酸的距离是154 bp。有趣的是，先前发现该变异的作者使用了AmpliSeq Designer定制panel（Life Technologies）用于Ion Torrent PGM测序仪。同时，应该指出，扩增子panel存在一些显著局限性：覆盖度不均一、检测CNV困难，但最显著的缺点是研究的基因数量少（例如，Staninova-Stojovska M.等人的定制panel仅包含15个基因，并且不包含某些息肉病综合征的基因，如RNF43、NTHL1、MSH3等）。

我们决定查明现代标准遗传性癌症NGS panel是否能检测到该变异。首先，我们分析了最大的oncopanel之一——NanOnco Plus Panel v3.0——它列出了637个基因，包括BMPR1A。c.-152-2A>G变异的坐标是10-86875865-A-G（GRCh38），根据制造商文档，该panel中BMPR1A基因的覆盖范围分别从10-86875981（探针）/10-86876018（靶标）开始，因此它将无法检测到此变异。此外，在我们的临床实践中，我们使用WES来研究遗传性结直肠癌患者的DNA，但事实证明c._152-2A>G变异也无法用WES检测到。

这些事实证实了我们决定使用WGS方法检测所有10个样本的相关性。

在Staninova-Stojovska M.等人2019年的工作中，BMPR1A的c.-152-2A>G变异被描述为致病性。重要的是，SpliceAI显示接受体丢失的概率为0.99，供体丢失的概率为0.89；Pangolin显示剪接位点丢失的概率为0.88。

我们做了一个重要且出乎意料的观察，即一名携带BMPR1A致病性变异的年轻女性患者发展出了超过100个腺瘤性息肉（通过内镜和形态学检查确定）。如此大量的大型腺瘤性息肉是APC变异引起的FAP年轻患者进行直肠结肠切除术的主要指征。相比之下，致病性BMPR1A变异主要引起JPS，后者并非 obligate 的癌前综合征。因此，鉴于预防性直肠结肠切除术对于JPS的可行性存在争议，此类患者的最佳手术治疗策略仍有待确立，需要进一步研究。

其余7名患者在不同基因中存在变异，包括那些负责息肉病发展的基因，但其中没有一个被归类为可能致病性或致病性。

我们想强调，采用不同的高通量测序方法（基因panel或全外显子组）将无法检测到我们患者中的胚系变异，因为它们位于APC和BMPR1A基因的非编码区。这进一步凸显了WGS作为对无法通过Sanger测序和MLPA进行基因诊断的患者进行分析的首选方法的重要性。

Conclusions

在本研究中，利用WGS，我们在10名经典FAP患者中的3名中鉴定出了APC和BMPR1A基因的致病性或可能致病性变异，这些患者之前通过标准基因方法（Sanger测序和MLPA）未能发现疾病原因。因此，WGS可能在诊断息肉超过100个的腺瘤患者中找到其应用定位。