利用环境DNA（eDNA）技术精准检测三种极危双髻鲨的保护优先区

《Frontiers in Marine Science》：Ghosts of the current: environmental DNA assays to detect conservation priority areas for three critically endangered hammerhead sharks

本研究开发并验证了针对三种极危小型双髻鲨（Sphyrna corona、S. media和S. vespertina）的物种特异性环境DNA（eDNA）检测方法，成功在哥伦比亚Uramba/Bahía Málaga国家自然公园实现原位验证。 assays表现出高特异性（无交叉扩增）、强线性（R2 > 0.99）及良好效率（0.848–0.908），为偏远浑浊海域的稀有物种监测提供了可扩展的分子工具包，支持基于证据的保护规划。

　　

1 引言

热带和亚热带海域超过四分之三的板鳃类动物（elasmobranchs）正面临灭绝威胁，主要原因是过度捕捞和栖息地丧失。尽管大型双髻鲨（如Sphyrna lewini、S. zygaena和S. mokarran）已受到较多研究和保护关注，它们的小型近缘种却仍被严重忽视。这些小型双髻鲨——包括Scalloped bonnethead（S. corona）、Scoophead shark（S. media）、Bonnethead shark（S. tiburo）、Pacific bonnethead shark（S. vespertina）等——体型较小，生态上局限于浅海沿岸生境，面临较高的渔业暴露风险，且繁殖输出有限，因而特别脆弱。根据国际自然保护联盟（IUCN）红色名录评估，S. corona和S. media均被列为极危（Critically Endangered），而S. tiburo为濒危（Endangered）。更令人担忧的是，S. corona和S. media已在墨西哥局部灭绝，分别自1994年和2007年后再无记录。

环境DNA（eDNA）技术作为一种新兴的保护工具，能够通过环境中遗留的遗传痕迹非侵入性地检测物种存在，特别适用于稀有、隐蔽或低丰度物种。在偏远或浑浊的生境中，传统调查方法（如BRUVS或视觉普查）往往难以实施，而eDNA则可实现快速、 scalable的生物多样性评估，为空间管理策略提供依据。

2 方法论

2.1 检测设计

针对三种目标物种——S. corona、S. media和S. vespertina，研究团队从GenBank下载了双髻鲨科及其他东太平洋常见板鳃类的线粒体NADH dehydrogenase subunit 2（ND2）和Control Region（CR）序列，并通过Geneious Prime软件进行比对。由于GenBank中缺乏S. corona和S. media的CR序列，作者还利用野外采集的组织样本进行DNA提取，并通过PCR扩增和Sanger测序获得这些序列。

引物和探针的设计遵循标准原则：长度18–25 bp，GC含量约40–60%，避免长同聚物（>4个相同碱基），最小化3′端互补性，并将扩增子长度限制在90–180 bp以适应降解的eDNA模板。每个assay的退火温度通过梯度测试确定，以确保特异性。

2.2 体外验证

使用合成gBlock（含目标扩增子序列）和共存板鳃类基因组DNA（如S. lewini、S. mokarran、Carcharhinus leucas等）评估assay的特异性。在58–64°C的退火温度梯度下测试，确定能特异性扩增目标物种的最高温度。随后，通过十倍系列稀释（从1×10⁷到10 copies/μL）评估效率、灵敏度（检测限，LOD）和定量性能（定量限，LOQ）。标准曲线通过绘制定量周期（Cq）值与log转换DNA浓度的关系生成，计算效率、斜率、截距和R2。LOD定义为≥95%重复扩增的最低浓度，LOQ则还需满足Cq值的变异系数（CV）≤35%。

2.3 原位验证

在哥伦比亚Uramba/Bahía Málaga国家自然公园的五个站点采集10 L海水样本（深度2 m），使用自动化泵和工厂无菌0.45 μm聚醚砜 cartridge滤器（Waterra）进行过滤。该封闭式过滤系统有效避免了现场污染，滤膜在主动抽吸前不暴露于环境空气或甲板溅水。滤器密封运输至实验室后，无菌切开成六部分分别提取DNA，使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue试剂盒，并经Zymo OneStep PCR Inhibitor Removal Kit纯化。每个样本运行八个技术重复，阳性检测需满足：至少一个技术重复扩增、无模板对照（NTC）无扩增、Sanger测序确认100%序列一致性。

3 结果

体外验证显示，所有assay均对目标物种高度特异，无交叉扩增，且无试剂污染。标准曲线效率在0.848至0.908之间，R2 > 0.99。S. corona和S. media assay的LOD为10 copies/μL，S. vespertina为5 copies/μL。

原位验证在公园内检测到所有三个物种。S. corona出现频率最高，在五个滤器中的四个检测到，且每个滤器有0–7个阳性重复；S. vespertina在三个滤器中检测到（0–3阳性重复）；S. media也在三个滤器中检测到（每个滤器一个阳性重复）。最北端的采样点（滤器1）未检测到任何物种。所有阳性检测经测序确认为100%匹配目标物种。

4 讨论

本研究首次成功开发并应用了针对三种极危小型双髻鲨的物种特异性eDNA检测方法。assay的高特异性和灵敏度使其能够可靠地检测痕量DNA，且所有阳性野外检测均经序列验证。由于eDNA在海水中存留时间较短（通常为数小时至数天），检测结果反映了近期的本地存在。

尽管扩增效率（0.848–0.908）略低于qPCR诊断的理想范围（0.9–1.1），但仍适用于生态学研究。assay的灵敏度支持对稀有物种的持续检测，但接近LOD的低信号需谨慎解读，尤其在场条件下可能受DNA降解、抑制或分布不均影响。

值得注意的是，由于S. tiburo物种复合体最近的分类修订（包括S. alleni的新描述和S. vespertina的重新评估），针对S. vespertina的assay实际上可能检测S. tiburo、S. alleni和S. vespertina三者。因此，该assay可在美洲大西洋和太平洋沿岸广泛应用。

在Uramba/Bahía Málaga国家自然公园的检测结果突显了该区域作为小型双髻鲨保护热点的重要性。S. corona的高检测频率与其声学遥测显示的高位点忠实性一致，支持该区域作为重点保护区的地位。而S. vespertina和S. media的较低检测频率可能反映其较低本地丰度或更 transient的栖息地使用。所有物种在最北端站点的缺失可能与圣胡安河淡水输入导致的盐度降低或更高渔业压力有关。

尽管本研究存在一些局限性（如所有站点均位于公园内、单时间点采样），但结果证明了eDNA在传统方法难以实施的偏远浑浊环境中检测低丰度板鳃类的强大能力。这些工具为快速生物多样性评估和空间保护规划提供了可扩展、非侵入性的方法，有助于逆转数据缺乏状况，促进全球最受威胁板鳃类的知情管理。