基于RNAi技术的星豹蛛Theta类谷胱甘肽S-转移酶PaGSTt1在溴氰菊酯解毒中的作用机制研究

《Frontiers in Physiology》：RNAi-based functional analysis of a theta-class glutathione S-transferase implicated in deltamethrin detoxification in Pardosa astrigera (Araneae: Lycosidae)

本研究通过分子克隆、生物信息学分析和RNA干扰技术，首次系统揭示了星豹蛛（Pardosa astrigera）Theta类谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因PaGSTt1在溴氰菊酯（deltamethrin）解毒中的关键作用。研究发现该基因在五龄若虫和雄性腹部高表达，受溴氰菊酯LC10/LC30/LC50浓度梯度诱导显著上调，RNAi沉默后使雄性蜘蛛死亡率增加34.54%，为天敌昆虫保护性农药开发提供重要分子靶点。

　　

引言

在农业生产中，化学防治因其速效性和高效性始终是害虫治理的主要手段。然而杀虫剂的过度使用也带来了环境污染、天敌自然控害能力破坏及生态失衡等负面效应。节肢动物中第二大类群蛛形纲动物在全球分布，在生态食物网和农业生态系统中扮演关键角色。星豹蛛（Pardosa astrigera）作为狼蛛科的一种地栖捕食性蜘蛛，广泛分布于东亚农业生态系统，在中国黄河流域和长江流域的小麦、棉花、玉米和水稻田中尤其丰富。该物种具有繁殖力高、捕食谱广、耐饥饿性强和运动迅速（特别是雄性）等优良生态特性。但合成杀虫剂的广泛使用对星豹蛛构成严重威胁，不仅促进害虫抗性发展，还直接或间接伤害包括蜘蛛在内的有益节肢动物。长期暴露于溴氰菊酯等杀虫剂会损害蜘蛛的生理、行为和生存能力，降低其害虫控制效能。因此研究蜘蛛在杀虫剂胁迫下的分子解毒机制，对农药环境风险评估和制定保护天敌的协同治理策略具有重要意义。

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs, EC 2.5.1.18）是一个多功能的超基因家族酶系，广泛存在于生物体中。在哺乳动物中，根据结构和酶学特征，GSTs可分为胞质GSTs（包括Alpha、Mu、Omega、Pi、Sigma、Theta和Zeta七个家族）、线粒体GSTs（Kappa家族）和微粒体GSTs（MAPEG家族）。GSTs参与多种生物学功能，包括农药代谢、抗氧化、激素转运和嗅觉处理等。近期研究强调了GSTs在介导杀虫剂抗性中的作用，例如家蚕BmGSTu2能够结合有机磷杀虫剂，飞蝗LmGSTs3的RNAi沉默增加了对 carbaryl 的敏感性。GST基因也在螨虫和蜱类等蛛形纲动物中被鉴定，但关于蜘蛛的研究仍有限。在昆虫中，Delta和Epsilon家族代表类别特异性GSTs，但在Theta家族GST基因方面缺乏全面研究。

材料与方法

蜘蛛采集与饲养

星豹蛛实验室种群采集自中国山西省小麦试验田，个体单独饲养于玻璃管中（直径1.5 cm，高8 cm），管内放置湿润棉花保持湿度。饲养在培养箱中（温度26°C ± 1°C，相对湿度60% ± 10%，光暗周期14:10 h）。三龄前饲喂果蝇（Drosophila melanogaster），之后饲喂黄粉虫（Tenebrio molitor）。

基因克隆与序列分析

使用成年雌雄星豹蛛个体进行基因克隆，在液氮下充分研磨成细粉，采用UNIQ-10柱式总RNA提取试剂盒提取总RNA。使用HiScript? II第一链cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA，通过PCR扩增PaGSTt1开放阅读框（ORF）。使用NCBI的CD-Search工具分析推定氨基酸序列的保守结构域，通过ExPASy ProtParam预测蛋白质基本理化性质，通过SignalP 5.0预测信号肽存在及切割位点，通过Cell-PLoc 2.0预测蛋白质亚细胞定位。使用ClustalX进行多序列比对，ESPript 3.0可视化结果，MEGA 6.0软件采用邻接法（NJ）构建系统发育树。

PaGSTt1基因时空表达模式检测

取20只成年雌雄星豹蛛用液氮麻醉后，在冰上快速解剖头胸、腹部和腿，同类型组织混合保存。 developmental stage分析采集60只二龄、35只三龄、20只四龄、10只五龄、4只六龄若虫以及4只成年雌蛛和4只成年雄蛛。以β-Actin作为内参基因，使用Primer Premier 5.0设计特异性引物，采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒在实时PCR系统上进行定量实时PCR（RT-qPCR）。

PaGST与溴氰菊酯的分子对接

通过在线服务器trRosetta采用同源建模预测PaGSTt1的三维结构，使用SAVES 6.0评估蛋白质模型质量，通过DoGSiteScorer预测潜在配体结合口袋。从PubChem下载小分子配体SDF格式文件，使用Open Babel软件转换为PDB格式，通过AutoDock软件为配体添加氢原子。对蛋白质结构进行去除水分子、添加氢原子并保存为pdbqt格式处理，在半柔性对接中进行配体与蛋白质的对接，使用Discovery Studio软件对接结果进行可视化分析。

溴氰菊酯胁迫后PaGSTt1基因表达水平检测

溴氰菊酯浓度基于研究组先前对星豹蛛的毒性生物测定结果：LC₁₀ = 5.151 mg/L，LC₃₀ = 8.619 mg/L，LC₅₀ = 12.311 mg/L。选择体型一致、发育正常的成年雄蛛，采用薄膜接触法进行溴氰菊酯暴露。在暴露后6 h、12 h、18 h、24 h和48 h采集样本，每个时间点取3只个体，立即冻存于液氮中。每个时间点和浓度进行3次生物学重复，RNA提取和cDNA合成方法同前，RT-qPCR程序与循环条件同前。

PaGSTt1基因在星豹蛛中的功能研究

使用T7 High Yield RNA转录试剂盒合成针对PaGSTt1的双链RNA（dsPaGSTt1）和对照绿色荧光蛋白基因（dsGFP）。按每只成年雄蛛1 μg dsRNA的标准剂量制备dsRNA-纳米载体复合物，使用微量注射器将混合物滴加于每只蜘蛛背部。在应用后3 h、6 h、12 h、18 h、24 h和48 h收集存活个体评估基因沉默效率，在每个时间点取样3只蜘蛛，实验重复3次。在基因沉默效率最高的时间点，采用LC₃₀浓度溴氰菊酯处理RNAi处理的蜘蛛，对照组包括仅H₂O处理、仅纳米材料（SPc）处理和dsGFP处理，每组30只成年雄蛛，进行3次独立生物学重复。在处理后48 h评估蜘蛛存活率，记录死亡数量。

结果

PaGSTt1的克隆与序列分析

基于星豹蛛转录组数据成功克隆PaGSTt1基因全长cDNA，序列长824 bp，包含678 bp的完整ORF，编码225个氨基酸。预测蛋白质分子式为C₁₂₁₀H₁₉₀₁N₃₀₉O₃₃₃S₉，分子量26.39 kDa，等电点（pI）8.79。不稳定性指数37.41表明蛋白质稳定，亲水性总平均值（GRAVY）为-0.305，表明PaGSTt1为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测PaGSTt1为胞质GST，无信号肽，属于非分泌蛋白。保守结构域分析显示PaGSTt1包含GST-N-Theta（残基3-78）和GST-C-Theta（残基92-212）结构域。与其他蛛形纲物种GST的多序列比对证实了这些结构域的保守性。PaGSTt1的N端区域呈现典型的β-α-β-α-β-α结构，而C端区域完全由α螺旋组成，缺乏β链。

使用NJ方法构建系统发育树，聚类分析表明PaGSTt1与其他蛛形纲GST蛋白质紧密分组，与拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）序列相似性最高，与QGA31151.1蛋白质序列一致性达98.22%。

PaGSTt1基因的时空表达

在星豹蛛不同发育阶段，PaGSTt1从二龄若虫到成虫阶段均有表达，其中五龄若虫表达量显著最高，六龄若虫表达量最低。在成年雌雄蛛不同组织（头胸、腹部和腿）中，PaGSTt1在所有检测组织中均有表达，腹部表达量最高，显著高于头胸和腿部。在相应组织中，雄蛛的PaGSTt1表达量显著高于雌蛛。

PaGSTt1与溴氰菊酯的分子对接

分子对接结果显示PaGSTt1与溴氰菊酯的结合能为-7.56 kcal/mol。氨基酸残基ARG（A:115）与蛋白质形成氢键，11个氨基酸残基参与疏水相互作用，5个氨基酸残基参与范德华力。

溴氰菊酯处理后PaGSTt1基因表达模式

在不同时间点，溴氰菊酯处理与对照（丙酮）在6 h、12 h和24 h时PaGSTt1相对表达无显著差异。18 h时所有处理组表达量均低于对照，且浓度越高表达量越低，处理组间存在显著差异。48 h时所有处理组表达量均高于对照，LC₃₀组表达最高，LC₁₀组最低，处理组间存在显著差异。

RNAi介导的PaGSTt1功能分析

RNAi效率评估显示，在所有六个时间点，PaGSTt1表达量均显著低于对照组，最有效的基因沉默发生在24 h，PaGSTt1表达降至对照水平的21.31%（敲低78.69%），48 h时表达部分回升。在最佳沉默时间点（24 h）暴露于LC₃₀溴氰菊酯后，RNAi处理组死亡率显著高于对照组，处理组死亡率73.98%，较对照（dsGFP）增加34.54%。

讨论

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是通过谷胱甘肽与多种内源性和外源性化合物结合，增强其溶解性和排泄性的关键解毒酶。在节肢动物中，GSTs在代谢异生素（包括杀虫剂）和缓解这些化合物诱导的氧化应激方面起关键作用。星豹蛛作为农业生态系统中的天然捕食者，在控制害虫种群方面发挥重要作用，因而暴露于多种杀虫剂。了解星豹蛛的解毒机制对评估农药使用的生态影响和制定可持续害虫治理策略至关重要。

本研究从星豹蛛中鉴定并表征了一个GST基因PaGSTt1，其全长cDNA序列824 bp，包含678 bp的ORF，编码225个氨基酸蛋白质。序列分析揭示了Theta类GSTs的特征性保守结构域，包括N端GSH结合位点（G-site）和C端疏水底物结合位点（H-site）。系统发育分析表明PaGSTt1与其他蛛形纲物种GSTs具有高度序列相似性。

组织特异性表达分析表明PaGSTt1在不同组织中差异表达，成年雌雄蛛腹部表达最高，该区域包含中肠、脂肪体和马氏管等关键解毒器官，提示PaGSTt1参与异生素的代谢处理。发育阶段分析显示五龄若虫阶段PaGSTt1表达升高，该阶段与摄食活动增加相关，因而可能更高程度暴露于膳食毒素。

溴氰菊酯胁迫下PaGSTt1表达呈现先下调后上调的模式，48 h的显著过表达与早期GST酶活性测定结果一致，推测PaGSTt1是参与星豹蛛溴氰菊酯代谢的关键GST基因。分子对接分析提示溴氰菊酯与PaGSTt1活性位点存在潜在结合亲和力，可能解释溴氰菊酯在星豹蛛中的代谢归宿。

RNAi沉默PaGSTt1表达后，蜘蛛对溴氰菊酯的敏感性增加，表明其解毒能力受损。这些发现与先前昆虫中GST基因RNAi沉默导致杀虫剂敏感性增加的研究一致。尽管本研究证明Theta类GST基因PaGSTt1在溴氰菊酯胁迫下显著上调，且其时间动态与总GST酶活性变化一致，但需要谨慎解释其具体功能。Theta类GSTs的主要生理作用可能更倾向于清除氧化应激产生的有毒次级产物，而非直接代谢杀虫剂本身。

本研究初步揭示了PaGSTt1在响应溴氰菊酯胁迫中的潜在作用，但仍存在若干局限：RNAi无法完全区分基因是直接参与解毒代谢还是间接影响整体生理状态；缺乏PaGSTt1蛋白体外生化验证其对溴氰菊酯的直接代谢能力。未来研究应包括室内选育溴氰菊酯抗性品系、异源表达重组PaGSTt1蛋白直接测定其催化溴氰菊酯代谢的动力学参数，以及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PaGSTt1敲除品系验证其功能。