基于增强CT影像组学的动态列线图预测GPC3阳性肝细胞癌：一种非侵入性靶向治疗筛选工具

《Frontiers in Oncology》：A novel dynamic nomogram based on contrast-enhanced computed tomography radiomics for prediction of glypican-3-positive hepatocellular carcinoma

本研究构建并验证了一种基于增强CT影像组学特征（Radscore）联合临床因素（AFP≥10 ng/mL、HBsAg阴性、年龄）的动态列线图模型，用于无创预测肝细胞癌（HCC）患者Glypican-3（GPC3）表达状态。该模型（AUROC=0.794）在内部验证中表现出优于单纯临床模型（AUROC=0.724）和影像组学模型（AUROC=0.722）的判别能力，校准曲线和决策曲线分析（DCA）证实其具有良好的校准度和临床实用性。该工具（https://zheyuzhou.shinyapps.io/GPC3nomogram/）有望为GPC3靶向治疗（如CAR-T细胞疗法）的患者筛选提供重要参考。

　　

背景

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，其5年总生存率仍然很差，发病率和死亡率持续上升。手术切除是HCC的首选治疗方法，但初诊时适合根治性手术的患者不足30%。尽管包括分子靶向治疗、免疫治疗和化疗在内的系统治疗已将中晚期HCC患者的中位生存期提高至约20个月，但大多数患者仍无法达到客观缓解。因此，迫切需要新的治疗靶点来改善中晚期HCC患者的预后。

Glypican-3（GPC3）是一种细胞膜糖蛋白，在胎儿期的肝、肺、肾组织中特异性表达，但在大多数成人组织中不表达。GPC3在HCC组织中高表达，而在良性肝病（如肝硬化和局灶性结节增生）中低表达或不表达。可溶性GPC3同样在HCC患者中水平升高，而在肝炎患者或健康个体中检测不到。因此，GPC3可能成为HCC的新型血清诊断标志物和治疗靶点。现有研究证实，接受肝切除术的GPC3阳性患者的5年生存率显著低于GPC3阴性患者，其表达是总生存期的独立预后因素。同时，GPC3 mRNA过表达与肝移植术后HCC复发显著相关。对于晚期HCC患者，GPC3高表达可能会降低贝伐珠单抗联合阿特珠单抗治疗的临床获益。微血管侵犯（MVI）是肝脏病理学中的重要指标，GPC3的阳性表达可显著增加HCC中MVI的发生率。总体而言，GPC3高表达与HCC的不良预后和治疗反应差相关。

影像组学是一种高通量方法，能够从常规图像中提取大量定量成像特征，以更好地反映肿瘤异质性，用于预测和诊断。已有几项研究基于磁共振成像（MRI）影像组学预测GPC3表达。例如，一项研究开发了钆塞酸二钠增强MRI影像组学模型，包含10个特征，其结合临床因素区分GPC3状态的受试者工作特征曲线下面积（AUROC）可达0.943。随着图像后处理技术的发展，基于增强计算机断层扫描（CT）的肝脏血管三维（3D）重建和肿瘤体积测量在临床实践中日益普及。增强CT在HCC的诊断和治疗中起着至关重要的作用，而基于CT影像组学预测GPC3表达的研究尚未深入。

方法

研究设计与纳入患者

回顾性分析了南京鼓楼医院2020年1月至2023年8月连续的HCC患者的医疗数据。由于回顾性病例对照研究的性质以及患者信息不可识别，南京鼓楼医院机构审查委员会豁免了书面知情同意的要求。本研究的纳入标准如下：首次诊断为HCC并接受肝切除术的患者；具备完整的临床病理和影像学数据。排除标准为：复发性HCC患者；缺乏术前增强CT影像；术前接受过系统或局部治疗；存在其他原发性恶性肿瘤。重要的是，两位作者独立执行患者筛选过程以确保一致性。

数据收集

纳入的HCC患者的血液检测数据在肝切除术前一周内获得，包括乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）、脱-γ-羧基凝血酶原（DCP）、血常规、肝功能和凝血功能。此外，还纳入了五种炎症和三种肝纤维化血清标志物，其相应计算公式见先前文献。基于术前增强CT判断肿瘤的数量和大小以及是否存在大血管侵犯（肿瘤侵犯肝静脉或门静脉分支）。所有纳入的变量均呈现在表中。

增强CT扫描方案

所有患者在肝切除术前两周内接受了腹部增强CT扫描。使用的造影剂为碘海醇注射液。使用256层多探测器CT扫描仪以轴位平面进行CT扫描，层厚为1.25毫米。在常规平扫后，患者按1.5毫升/公斤注射碘海醇。动脉期（AP）图像在注射造影剂后30秒采集，静脉期（VP）图像在动脉期结束后30秒开始采集。

影像组学分析

以DICOM格式导出纳入患者的增强CT动脉期和静脉期图像。两位作者使用3D Slicer软件的Segment Editor模块手动分割肿瘤并在每层图像上勾画感兴趣区域（ROI）。使用Python中的SimpleITK模块将图像重采样为1×1×1毫米³大小的体素以标准化体素间距。默认情况下，图像重采样应用B样条插值（阶数=3），而ROI掩膜使用最近邻插值（阶数=1）以保留分割边界。使用基于Python的PyWavelets包对所有增强CT序列进行小波变换以减少图像噪声并标准化强度。最后，使用PyRadiomics包从每个ROI的七种图像类型中提取1316个影像组学特征，包括形状特征、一阶强度特征以及从可用滤波器（例如小波、高斯拉普拉斯[LoG]和平方）导出的高阶纹理特征。

所有提取的1316个影像组学特征在筛选前使用z-score进行标准化。随后，使用基于R语言的irr包计算两位作者提取的ROI特征的组内相关系数（ICC），保留ICC > 0.8的特征。根据GPC3阳性和阴性分组，使用基于glmnet包的最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归筛选对GPC3状态最具预测性的特征。然后，通过10折交叉验证在lambda.min处获得最优特征集。最终，使用R语言的glm函数建立通过影像组学特征预测GPC3状态的逻辑回归模型，并计算Radscore。

组织病理学检查

采用光镜下提出的标准评估HCC细胞中GPC3的表达。在代表性肿瘤区域内至少随机选择五个高倍视野进行检查，根据阳性HCC细胞（细胞膜和细胞质中出现棕色反应产物）的比例，将表达等级分为0至3+。0级对应于阳性率低于5%的HCC细胞，1+级表示5-10%的阳性率。2+级和3+级分别代表10-50%和超过50%的阳性率。基于上述免疫组织化学分析，GPC3阳性定义为阳性细胞率≥10%（2+级和3+级）。所有肝切除标本由两名病理学家独立分析，任何分歧均通过讨论解决。

统计学分析与模型开发

使用χ²检验和Mann-Whitney U检验比较两组间临床变量的差异。随后的多变量逻辑回归分析纳入了单变量分析中p<0.2的变量。与影像组学模型（Radscore）建立方法类似，使用glm函数建立临床模型和组合模型。为了使组合模型使用更方便，使用DynNom包开发了一个移动在线预测工具。最后，使用ROC曲线、决策曲线分析（DCA）和校准曲线分别评估三个模型的诊断准确性、净获益和校准度。由于整个数据集用于模型构建，进行了10折交叉验证用于内部验证。

结果

入组患者与基线信息

根据纳入标准，本研究共纳入181例来自南京鼓楼医院的HCC患者。其中，75例（41.4%）为GPC3阴性HCC，106例（58.6%）为GPC3阳性HCC。随后对两组间的临床变量进行比较。AFP ≥ 10 ng/mL、年龄、HBsAg阴性、女性性别、AST、NLR、ANRI和MLR与GPC3表达相关性较高（p<0.2）。最后，多变量逻辑回归分析确定了四个变量是GPC3阳性的独立预测因子（p<0.05）。

影像组学特征分析

746个ICC > 0.8的特征被判定为稳定特征。随后的LASSO回归分析最终确定了五个与GPC3表达显著相关的关键影像组学特征。已识别特征的详细信息和权重系数如图所示。Radscore的计算公式如下：Radscore = 1.041 + 0.668 × (wavelet.LHL.gldm.SmallDependenceEmphasis) + 0.403 × (wavelet.HHL.glszm.SizeZoneNonUniformityNormalized) + 0.371 × (wavelet.HHH.gldm.SmallDependenceHighGrayLevelEmphasis) - 1.458 × (wavelet.HLL.firstorder.Median) - 0.051 × (wavelet.LLL.gldm.LargeDependenceLowGrayLevelEmphasis)。

模型开发与评估

影像组学模型由Radscore中的五个特征组成，其敏感性为66.7%，特异性为76.4%，AUROC为0.722。相比之下，临床模型包含三个GPC3阳性的独立危险因素（AFP ≥ 10 ng/mL、HBsAg阴性和年龄），其敏感性为62.7%，特异性为79.3%，AUROC为0.724。为了进一步提高模型的诊断准确性，建立了一个整合Radscore和临床变量的综合列线图模型。该动态列线图可作为移动应用程序免费获取。整合模型将AUROC提高至0.794，敏感性为85.9%，特异性为70.7%。值得注意的是，使用10折交叉验证获得的AUROC的95%置信区间（CI）为0.729-0.860。此外，DCA显示，整合模型比影像组学模型和临床模型能提供更高的净获益。校准曲线表明预测的GPC3状态与实际GPC3状态高度一致。

讨论与结论

全球范围内晚期HCC患者的5年生存率约为12%。同时，接受手术切除、肝移植或消融治疗的早期和中期HCC患者的5年累积复发率可高达70%。因此，探索新的治疗靶点以改善晚期和复发患者的预后对于提高HCC整体长期生存至关重要。

GPC3已被证明是HCC的潜在治疗靶点。多项I期临床试验已证实，嵌合抗原受体（CAR）-GPC3-T细胞疗法对于晚期HCC患者是安全的，同时观察到了初步有效的抗肿瘤活性。结合纳米技术和CAR-T细胞疗法的新型治疗策略甚至为增强抗肿瘤效果提供了新方向。此外，值得注意的是，先前两项使用GPC3衍生肽疫苗作为根治性手术或射频消融后辅助治疗的II期试验证实，该肽疫苗显著降低了HCC的复发，尤其是在GPC3阳性患者中。然而，识别具有高GPC3表达的目标人群是未来临床试验和临床实践中的一个关键问题。换言之，GPC3阴性HCC患者无法从这种靶向治疗中获益。

肝活检是评估肝脏疾病性质和严重程度的金标准。测量值约为肝脏总质量1/50000的活检标本可能无法代表整个肝实质。另一方面，标本的长度和直径可能影响评估的准确性。临床诊断的中晚期HCC患者在开始靶向治疗和免疫治疗前需要进行肝活检以明确病理诊断。由于HCC已被证明具有广泛的瘤内异质性，活检标本的GPC3表达状态可能存在偏差。此外，晚期HCC常合并肝硬化，导致血小板减少和凝血功能障碍，增加了活检出血的风险。HCC针道种植转移的风险也可能使部分患者失去转化治疗的机会。因此，影像组学作为一种新兴的无创诊断方法，在预测肿瘤整体GPC3表达方面具有关键优势。尽管本研究中筛选的影像组学特征（一个一阶特征和四个灰度纹理特征）在以往的HCC相关影像组学研究中未出现，但SmallDependenceEmphasis曾用于预测头颈部鳞状细胞癌治疗前CD8+ T细胞的浸润状态，而SizeZoneNonUniformityNormalized被发现与肿瘤分级相关。此外，有报道称firstorder.Median对胰腺导管腺癌的早期检测有价值。这些表明基于CT的影像组学能够有效反映肿瘤异质性。

本研究发现年龄是GPC3阳性的保护因素，这与之前的研究结果一致。GPC3阳性患者较差的预后可能与该HCC亚型较高的肿瘤侵袭性有关，表现为更频繁的血管侵犯、更高的肿瘤数量和更晚的肿瘤分期。一项基础研究探讨了这种现象的潜在机制。表达高水平GPC3的HCC细胞HepG2表现出显著的上皮-间质转化样改变。同时，细胞划痕和transwell实验证实这些细胞具有增强的迁移和侵袭能力。值得注意的是，一项基于监测流行病学和最终结果（SEER）数据库10,145例患者的分析表明，诊断HCC时的肿瘤分期越晚，患者越年轻，HCC生长越快。另一项大样本回顾性研究也报道年轻患者具有更具侵袭性的肿瘤因素。这或许可以解释为什么年轻的HCC患者更容易表达GPC3。

AFP是HCC的传统生物标志物。分泌AFP的HCC比AFP阴性的HCC更具侵袭性，单细胞测序揭示AFP阳性HCC患者具有抑制性的肿瘤免疫微环境。贝伐珠单抗联合阿特珠单抗已成为晚期HCC患者的一线系统治疗选择。深入的分子分析表明，高AFP和GPC3（癌胚基因）表达与临床获益降低相关。这证实了在预后不良的HCC患者中，AFP和GPC3的表达可能存在一致性。此外，初步和更新的荟萃分析验证了结合升高的AFP和GPC3可以提高诊断HCC的准确性。由于有报道称AFP调节因子2也是GPC3的调节因子，这解释了AFP阳性（≥ 10 ng/mL）是GPC3阳性危险因素的调控机制。

先前一项研究报告，从增强CT动脉期选出的5个特征结合AFP可以预测GPC3阳性表达。然而，作者未提供Radscore的计算公式或构建列线图模型。换言之，读者无法参考该结果进行临床预测。基于用户友好的列线图开发移动应用程序是本研究的一个主要优势和关键创新点。此外，我们的研究同时从动脉期和静脉期提取特征，从而充分利用了增强CT成像提供的信息。这有助于医生的临床决策，并为基于增强CT影像组学预测HCC患者GPC3表达提供了更坚实的基础。

单中心回顾性研究的性质是本研究的一个主要局限性，它限制了样本量并不可避免地导致选择偏倚。例如，先前研究报道HBsAg阳性与GPC3阳性相关。一项研究报道，在80例GPC3阳性HCC患者中，62例（77.5%）为HBsAg阳性。而在22例GPC3阴性患者中，该比例仅为31.8%（7/22）。另一项包含755例HCC患者的研究显示，GPC3阳性和阴性患者中的HBsAg阳性率分别为78.7%和72.1%（p=0.042）。由于在连续患者中排除了缺乏术前增强CT和DCP的患者，由此产生的选择偏倚可能是HBsAg阴性成为高GPC3表达预测因子的原因。然而，我们基于预定义标准严格筛选连续患者以尽量减少偏倚。尽管缺乏外部验证队列阻碍了模型普适性的充分验证，但10折交叉验证是提高模型稳定性的公认方法。我们提供了全面的基线数据以便与其他人群进行比较，但未来仍需要多中心研究来验证我们的发现。

总之，鉴于HCC的瘤内异质性和肝活检带来的潜在并发症，我们的临床预测工具令人满意地识别了GPC3状态，并可能有助于临床决策。对于外科医生而言，早期识别高风险GPC3阳性患者（风险分层）可能有助于采用更宽的切除边缘或解剖性肝切除术。对于肿瘤学家而言，提出的列线图可能有助于识别合适的候选人群以纳入未来的GPC3相关临床试验。对于病理学家而言，我们的模型可作为提高诊断准确性的参考。