MEF2与SIX家族转录网络调控日粮NFC/NDF比例诱导藏绵羊肌肉发育与肉品质的表观遗传景观

《Frontiers in Nutrition》：Epigenetic landscape reveals MEF2 and SIX family-mediated transcriptional networks underlying dietary NFC/NDF ratio-induced muscle development and meat quality in Tibetan sheep

本研究通过整合表型分析（生长性能、肉品质、肌肉组织形态）与多组学技术（ATAC-seq、H3K27ac CUT&Tag、RNA-seq），系统揭示了不同非纤维碳水化合物/中性洗涤纤维（NFC/NDF）比例日粮通过激活增强子并富集MEF2和SIX家族转录因子结合位点，进而调控脂肪酸代谢、上皮细胞增殖和巨噬细胞趋化等通路关键基因（如EGR3、FGF7、HPGD、C5、EDNRB）表达，最终优化藏绵羊肌肉发育和肉品质的分子机制。该研究为畜禽精准营养策略提供了重要理论依据。

　　

引言

肉类是人类重要的蛋白质来源，直接影响人类健康和生活质量。在各类肉类中，羊肉因其高蛋白、低脂肪和低胆固醇含量而备受中国消费者青睐。随着人们对营养和安全问题的关注日益增加，对优质羊肉的需求持续增长。动物日粮中非纤维碳水化合物（NFC）和中性洗涤纤维（NDF）的比例已知会显著影响其肌肉生长、瘦肉产量、肉风味和肌纤维结构。藏绵羊以其抗逆性和优越的肉品质而闻名，其独特的生长环境使其成为研究不同日粮NFC/NDF比例对肌肉表型性状影响的分子机制的理想模型。

根据全基因组关联研究，与肌肉品质性状相关的大多数单核苷酸多态性（SNP）位于藏绵羊的非编码区域，特别是在调控元件中。例如，增强子通过改变染色质构象和特定的组蛋白修饰，在不同时间点调控不同组织中的基因表达，从而影响发育和其他复杂的生物学过程。对这些增强子进行全面注释有助于我们理解日粮NFC和NDF影响家畜肌肉表型和肉品质的潜在调控机制。

增强子是位于转录起始位点（TSS）上游和下游的非编码DNA序列，通过促进其与转录因子的相互作用来调控基因的转录活性。增强子的一个关键特征是其能够不受位置和方向影响地调控基因表达。这些元件通常位于开放染色质区域，对于转录因子结合和基因调控至关重要。增强子富含组蛋白修饰，例如H3K27ac，这证明了其作为活性调控元件的作用。

RNA测序（RNA-seq）可以提供关于增强子调控靶基因的关键见解，从而识别特定条件下基因表达的改变。这可以揭示哪些基因可能被特定增强子调控。同时，高通量测序转座酶可及染色质测定（ATAC-seq）是一种检测开放染色质区域的有效方法。此外，靶向活性增强子组蛋白修饰（例如H3K27ac）的CUT&Tag技术能够精确识别这些区域。这三种技术的结合有助于系统性地识别增强子，并提供关于它们在基因调控网络中的作用及其对基因转录影响的信息。

然而，目前关于日粮营养素如何通过表观遗传机制影响家畜肌肉表型和肉品质的研究仍然有限。大多数研究集中于分析日粮成分对肌肉生长和肉品质的直接影响，而其潜在的分子调控机制，特别是增强子介导的转录调控网络，仍然很大程度上未知。鉴于组蛋白修饰在基因表达调控中的关键作用，深入研究饲喂不同NFC/NDF比例所诱导的肌肉组织增强子组蛋白修饰的变化，有望揭示藏绵羊肌肉性状和肉品质形成的关键调控机制。

材料与方法

动物伦理

本研究根据ARRIVE指南进行，并得到青海大学动物护理委员会的批准。所有涉及动物的实验程序均遵守机构指南和青海大学伦理委员会制定的实验动物管理与福利规定。研究方案旨在尽量减少动物痛苦并减少使用的动物数量。

实验设计与样品采集

实验于2021年3月1日至7月6日在青海省贵南县黑黄羊育种中心进行。实验对象为2月龄断奶雄性藏绵羊，初始体重为10.45 ± 0.96 kg。采用完全随机研究设计，将90只羊随机分配到三个处理组，每组30只羊。每个处理组由5个栏组成，每栏6只羊。这三个处理组的日粮NFC/NDF比例分别为0.71（L组）、1.16（M组）和1.82（H组）。羊日粮由粗饲料（燕麦青贮和燕麦干草，以1:1干物质比例混合）和精料组成。各组日粮组成见表1。每天08:30和16:30投喂两次，羊只自由采食和饮水。

实验期结束时，从每组的不同栏中随机选择3只羊以确保栏间代表性采样。选定的羊被运送到当地屠宰场，在待宰栏中停留12-24小时，期间可饮水但无饲料，随后按照标准商业程序屠宰。屠宰后立即（死后30分钟内）从所有屠宰羊只的第12和第13肋骨之间采集腰最长肌。每份肌肉样品分为三部分：第一部分立即用于新鲜肌肉的pH值和质构分析；第二部分用福尔马林固定用于组织学分析；第三部分在液氮中速冻并保存在-80°C用于后续分子分析。

生长性能评估

在实验期结束时测定每只羊的活重。随后实施标准化屠宰方案，去除头、蹄和内脏器官，获得带骨胴体。精确称量胴体重，并计算屠宰率：屠宰率（%）= （胴体重 / 活重）× 100。

肉理化特性评估

从第12和第13肋骨区域切取腰最长肌样品，使用校准的便携式pH计进行pH测量。pH电极插入肌肉组织深度为2 cm。记录死后45分钟内的初始pH值，并在死后24小时测定最终pH值。测量前，使用标准缓冲溶液（pH 4.01和6.86）进行两点校准以确保分析精度。使用CT3质构分析仪进行质构剖面分析，以评估平行于肌纤维方向的立方体样品（1 cm³ × 1 cm³ × 1 cm³）的硬度和咀嚼性。为测定解冻损失，肉样在4°C下解冻12小时，然后用滤纸轻轻吸干表面渗出液后准确称重。解冻损失百分比计算公式为：解冻损失（%）= （（冷冻前重量 - 解冻后重量）/ 冷冻前重量）× 100。将解冻后的肉样在85°C水浴中加热20分钟，随后冷却至室温，用吸水纸吸干表面水分后称重。所有蒸煮在同一批次中进行以消除批次效应。样品随机分配在蒸煮容器内以确保受热均匀。蒸煮损失百分比计算公式为：蒸煮损失（%）= （（蒸煮前重量 - 蒸煮后重量）/ 蒸煮前重量）× 100。

肌肉组织学分析

腰最长肌的组织学分析在思科科学生物技术有限公司（天津）进行。苏木精-伊红（HE）染色按照Zhang等人描述的方案进行。切片首先经脱蜡处理，使用脱水机和包埋站等实验室设备进行处理。染色过程中，切片先用苏木精染色，使细胞核呈蓝色。经过梯度酒精浓度脱水后，切片用伊红染色，使细胞质呈红色。染色后，切片经透明处理，用中性树脂封片以便长期保存和显微镜分析，并使用尼康Eclipse E100正置光学显微镜进行检查。

测序文库构建与数据处理

使用先前报道的方法从冷冻肌肉细胞中提取细胞核，并使用商业试剂盒构建ATAC-Seq和CUT&Tag文库。每个CUT&Tag检测系统需要3 μg的抗H3K27ac抗体。使用Nova-PE150策略进行高通量测序。

使用Trim Galore软件去除接头序列和低质量读数。使用Bowtie2软件进行读数比对。使用Sambamba软件去除低质量比对和重复读数。随后，使用bedtools bamCoverage工具将bam文件转换为bigWig文件以可视化读数信号的富集情况。最后，使用macs2软件进行peak calling。使用HOMER软件对每个peak summit前后100-bp区间进行转录因子motif富集分析。

IDR peaks识别与合并

使用idr软件处理组内peaks以获得一致的组内peaks，称为idr peaks。合并peaks的获取分为三个步骤：首先，使用samtools软件合并所有样品的bam文件；然后，使用macs2软件对合并后的bam文件进行peak calling；最后，使用bedtools intersect工具选择与idr peaks重叠的peaks，参数设置为-F 0.5。

使用featureCounts软件生成peaks的读数计数矩阵。使用edgeR软件对读数计数矩阵进行标准化（TPM）并校正文库大小，获得最终的peak信号矩阵。基于Ensembl数据库中藏绵羊基因组的注释文件，生成TSSs邻近区域（上游1 kb，下游500 bp）的位置文件。动态peaks定义为在L、M和H组间显示最高方差（变异系数>0.5）的前5,000个增强子。启动子被分类为位于TSS ± 1.5 kb范围内且与H3K27ac/ATAC-seq peaks重叠的peaks；增强子则是超出此范围的peaks。

功能富集分析

基于基因组区域注释富集工具（GREAT）原理，识别基因的调控区域（TSSs上游5 kb，下游1 kb）。然后将与调控区域重叠的基因组区域分配给相应的基因。如果调控区域没有重叠的基因组区域，则将最近的基因组区域（<1 Mb）分配给相应的基因。使用eggnog-mapper软件对绵羊基因进行功能注释。随后，使用AnnotationForge和clusterProfiler R包对相关基因进行功能富集分析。

转录组分析

使用TRIzol试剂从藏绵羊腰最长肌中提取总RNA。使用Agilent 2100和NanoDrop 2000系统评估RNA的浓度和质量，以确认RNA样品适用于下游文库构建。选择性去除核糖体RNA（rRNA）以保留所有编码和非编码RNA。剩余的RNA随机片段化，并用作模板，用随机六聚体引物合成第一链cDNA。随后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I以促进第二链cDNA的合成。进行UNG酶处理，随后进行末端修复、加A尾和测序接头连接。通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的200-bp片段，并通过PCR扩增以构建测序文库。

使用NEB#7530试剂盒制备cDNA文库，进行质量检查，并在广州基诺德生物科技有限公司的Illumina HiSeq 2500平台上进行测序。使用fastp评估测序数据质量，使用FASTX工具包修剪低质量碱基和接头。使用TopHat2将高质量序列比对到绵羊参考基因组。根据FPKM识别差异基因表达，并使用Cuffdiff进行三组间的比较分析。使用Gene Ontology（GO）数据库对差异表达基因（DEG）进行功能注释。使用GOseq R包和KOBAS软件进行富集分析，显著性阈值设定为FDR ≤ 0.05。为了验证RNA-Seq数据的可靠性，选择了五个基因进行定量实时PCR（qRT-PCR）分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。本研究中使用的所有引物序列见表2。

数据分析

使用R软件进行统计分析。使用单因素方差分析（ANOVA）评估三个日粮组（L、M、H）之间的差异，随后进行Tukey事后检验，显著性水平设定为p < 0.05。对于ATAC-Seq和H3K27ac CUT&Tag数据，使用macs2进行peak calling，并应用不可重复发现率（IDR）方法识别组内一致peaks。将peak信号标准化为每百万转录本（TPM）并使用edgeR校正文库大小。使用STEM软件识别三组间显著富集的peak profiles。使用HOMER在peak summits周围100-bp区间进行转录因子motif富集分析。对于RNA-Seq数据，使用TopHat2将clean reads比对到藏绵羊参考基因组，并使用Cufflinks将转录本丰度量化为FPKM。使用Cuffdiff识别差异表达基因（fold change ≥ 2, p < 0.05）并使用Gene Ontology数据库进行功能注释。通过使用GREAT方法将peaks分配给其潜在靶基因，进行表观基因组和转录组数据的整合。我们进行了全面的多组学关联分析，以探索组学内部和组学之间的相关性。分析框架包括两种互补的可视化方法：组学内部相关性使用热图显示所有表型性状之间的两两相关系数，揭示形态和生理特征的相互关联性；组学间相关性通过网络图表示，说明差异表达基因（DEGs）与表型性状之间的关联。这种基于网络的方法能够识别关键的基因-性状关系和潜在的调控连接。使用Spearman等级相关系数评估所有基因-性状关联，以解释数据中潜在的非线性关系。使用调整后的p值确定统计学显著性。所有相关性分析和可视化均使用R软件及相关包进行，包括用于热图的corrplot和用于网络构建的igraph。

结果

生长性能评估

不同比例的非纤维碳水化合物（NFC）和中性洗涤纤维（NDF）对藏绵羊的生长性能产生了显著影响。结果表明，H组羊的活重和屠宰率显著高于M组。此外，H组的胴体重显著高于M组和L组。

肉理化特性评估

对肉理化特性的评估显示，L组和M组的初始pH（0小时）、蒸煮损失、解冻损失、咀嚼性和硬度参数值显著高于H组。

肌肉组织学评估

肌肉横切面的组织学检查揭示了L、M和H组之间不同的形态模式。H组显示出最有利的肌纤维特征，包括有序的纤维排列、清晰的肌束结构和明确的肌周轮廓。此外，该组的肌纤维显示出均匀的大小分布和适当的肌间间距，表明肌肉发育最佳。相比之下，L组表现出相对不规则的纤维排列、可变的纤维大小和不太清晰的肌束结构，表明组织组织结构较差。M组表现出纤维断裂和过大的肌间间距，表明组织完整性差。

ATAC-Seq和H3K27ac CUT&Tag识别的高质量peaks

我们构建了饲喂三种不同NFC/NDF比例（低、中、高）日粮的藏绵羊肌肉组织的ATAC-Seq和CUT&Tag文库。对这些文库进行高通量测序后获得原始fastq文件。进行了多个处理步骤，包括读数比对、低质量和重复读数去除、peak calling以及peak读数计数计算和标准化。H3K27ac CUT&Tag数据平均包含30 M reads/样本，而ATAC-Seq数据平均包含50 M reads/样本。这些样品的测序深度被认为符合ENCODE的建议。识别出约60,000至110,000个CUT&Tag peaks和70,000至80,000个ATAC peaks。然后，应用不可重复发现率（IDR）方法筛选具有优异组内一致性的peaks，以确保保留peaks的可靠性。最终，识别出约30,000至60,000个CUT&Tag IDR peaks和40,000至50,000个ATAC-Seq IDR peaks。后续分析基于这些IDR peaks。相似性分析显示，通过两种方法获得的数据显示出优异的组内重复性和组间异质性。这些发现验证了藏绵羊肌肉表观基因组分析所获高通量数据的高质量性质。

ATAC-Seq和H3K27ac CUT&Tag peaks的异质性全基因组分布

ATAC-Seq和H3K27ac CUT&Tag peaks的全基因组分布偏好相似。大多数peaks分布在非编码区域，包括启动子、5'非翻译区（UTR）、3' UTR、内含子和远端基因间区域。特别是，远端基因间区域包含了大部分ATAC和CUT&Tag peaks（50%），其次是启动子和除第一个内含子以外的其他内含子。这与先前的证据一致，表明增强子是远端调控元件，并且比启动子更丰富（每个启动子通常对应多个增强子）。具体而言，约50%的ATAC和CUT&Tag peaks分布在TSSs的远端区域（距离10–100 kb）。同时，只有约20%的peaks位于TSSs的近端区域（距离1–10 kb）。这些结果强调了远端CREs在藏绵羊表观遗传调控中的重要性。

增强子对NFC/NDF比例变化的敏感性

由于活性启动子和增强子通常位于开放染色质区域，因此过滤了与ATAC-Seq peaks重叠的H3K27ac CUT&Tag peaks用于后续分析，以确保H3K27ac peaks的有效性。动态H3K27ac peaks富集了与肌肉发育和脂肪酸代谢相关的GO terms，表明NFC/NDF比例的变化影响这些生物学过程。随后，将位于TSSs附近（上游1 kb，下游500 bp）的H3K27ac peaks分类为启动子，其余的分类为增强子。L、M和H组中启动子的数量（6404–7291）相对稳定，而增强子的数量（25358–35444）波动很大。此外，三组间增强子信号强度的方差显著高于启动子信号强度的方差。总体而言，增强子在数量和信号强度方面似乎都比启动子更易波动。结合GO注释结果，这些发现表明增强子比启动子对NFC/NDF比例的变化更敏感。事实上，增强子富集了MRF和MEF2家族的多个成员，包括MEF2C、MEF2B、MEF2D、MEF2A和MYOG。相比之下，启动子没有显示出这种富集。

上调增强子在肌肉发育中的作用

使用STEM软件探索三组样品中的增强子信号，以L组作为对照/参考基线，代表最低的NFC/NDF比例（0.71）。这为分析提供了方向性参考点，其中log2FC代表相对于该基线的增强子信号水平的log2（倍数变化）。随后，识别出四个上调和两个下调profile。上调profiles（曲线0–3）显示随着NFC/NDF比例在组间增加（L → M → H），H3K27ac信号水平逐渐增加，表明增强子激活与较高的NFC/NDF比例相关。相反，下调profiles（曲线4–5）显示出相反的模式，随着NFC/NDF比例增加，H3K27ac信号水平降低。上调增强子高度富集于与肌肉中细胞增殖、分化和器官发育相关的GO BP，包括肌动球蛋白结构组织、干细胞分化、肌肉细胞增殖和肌原纤维组装。同时，下调增强子高度富集于与基础代谢相关的GO BP terms，包括葡萄糖代谢过程、己糖代谢过程和单糖代谢过程。这些结果表明，由于NFC/NDF比例增加而上调的增强子参与了肌肉发育的调控。然而，下调增强子未显示这种参与。因此，对上调增强子的分析可能揭示NFC/NDF比例对藏绵羊肌肉性能的影响。

上调增强子富集MEF2和SIX motifs

Motif富集分析显示上调和下调增强子对转录因子有不同的偏好。具体而言，上调增强子富集了MEF2家族成员（MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D）和SIX家族成员（SIX1、SIX2和SIX4），它们密切参与肌肉发育的调控。相反，下调增强子特异性富集了MITF、JUNB、FOSL2、FOS、BATF和ATF3。这些结果表明，上调增强子可能通过招募MEF2s和SIXs来响应NFC/NDF比例的变化，从而影响藏绵羊的肌肉性能。此外，具有相似富集倾向的转录因子motifs显示聚类，这反映了它们的协同作用。其中，HOXC9和THRA与MEF2s（MEF2D、MEF2A、MEF2B和MEF2C）聚集在一起。同时，NF1和CTCF与SIXs（SIX1、SIX4和SIX2）聚集在一起。结果进一步证明了介导改变NFC/NDF比例对藏绵羊肌肉性能影响的潜在调控因子。

转录组分析

通过RNA-seq转录组分析验证了表观遗传调控对关键肌肉发育基因的功能影响，利用了ATAC-Seq识别的染色质可及区域和CUT&Tag检测到的转录因子结合位点。在转录组分析期间，所有样品的原始读数范围在42.77至53.86百万之间，平均测序深度为47.78百万读数，为后续分析提供了充足的数据支持。经过质量控制和过滤后，所有样品的有效读数保留率均高于99%，表明原始数据质量高。Q20百分比范围从97.41%到98.41%，平均为97.99%，而Q30百分比范围从92.7%到95.18%，平均为94.12%。这表明测序结果具有高准确性，绝大多数碱基的测序质量良好。样品的GC含量相对稳定，范围从53.04%到55.7%，平均为54.24%，接近正常基因组GC含量，无显著偏差。

NMDS分析揭示了实验组之间的明显分离，表明与不同非纤维碳水化合物（NFC）和中性洗涤纤维（NDF）比例相关的转录组表达模式存在显著差异。为了确保数据的可比性和有效性，排除了具有缺失值的基因，并使用维恩图说明比较组之间共同富集的基因。随后，使用这些差异表达基因进行GO富集分析，揭示了在上皮细胞增殖、脂肪酸代谢过程和巨噬细胞趋化途径中的显著富集，所有这些都与肌肉发育相关。整合维恩图和GO富集分析确定了五个核心差异表达基因：EGR3、FGF7、HPGD、C5和EDNRB。

为了验证数据可靠性，对这六个基因进行了RT-qPCR定量分析。这些基因的表达模式显示出一致的上调和下调趋势，从而证实了RNA-Seq数据的可靠性。相关性分析显示，差异表达基因HPGD、C5和EDNRB与活体重、热胴体重和屠宰率呈显著正相关。差异表达基因EGR3和FGF7与pH_45min、pH_24h、解冻损失、蒸煮损失、硬度和咀嚼性呈显著正相关。每个表型性状和差异表达基因对的完整统计数据，以及每个表型性状之间的相关性统计数据见补充表S2、S3。

讨论

动物的生长和发育包含一个复杂的综合系统，其特征是身体组织的结构和质量改变。这个系统有效地展示了营养物质在不同组织和器官中的差异积累模式。它也是评估藏绵羊饲养管理和营养状况的关键参考参数。这些测量参数能够清晰评估个体动物的生长和发育过程，同时有助于提高生产效率。在本研究中，当NFC/NDF比例达到1.82时，活重、胴体重和屠宰率显著提高。这表明，日粮NFC水平升高，其特征是快速发酵碳水化合物增加，有助于提高藏绵羊的活重，从而改善屠宰率和胴体重。这些发现与先前的报告一致，表明增加日粮精料水平可增强营养吸收并改善生长性能和饲料转化效率。

肉理化品质与日粮营养水平密切相关，不同的能量浓度可有效改善肉品质。pH变化与肌糖原储备高度相关。在本实验中，pH_45min值随着NFC/NDF比例的增加而显著降低，而在pH_24h时三组之间没有观察到显著差异。先前的研究表明，糖原分解过程中的乳酸积累会降低肌肉pH，底物可用性和糖酵解酶活性协同调节这一过程的速率和程度。这表明升高的NFC/NDF比例可能促进快糖酵解肌纤维的发育，从而加速藏绵羊的生长，这与活重数据相印证。解冻损失和蒸煮损失是肌肉持水能力和肌纤维结构完整性的指标。肌纤维发育决定细胞膜系统的完整性，成熟的纤维表现出发育良好的肌浆网和线粒体结构，维持最佳的细胞内和细胞外水分平衡。在NFC/NDF比例为1.82时，解冻和蒸煮过程中的水分损失显著减少，表明肌纤维发育增强，具有最佳的肌原纤维间距，创造了理想的持水能力。硬度和咀嚼性根本上由肌肉发育过程中的肌纤维类型分化和成熟决定。随着NFC/NDF比例的增加，肌肉硬度和咀嚼性呈现显著下降趋势，表明肉嫩度得到有效改善。这些结果与先前实验揭示的肌肉发育特征一致，进一步证实了营养调控策略通过改变肌纤维发育模式来调节肉品质特性。

组织学分析提供了反刍动物肌肉组织的全面形态学评估，是评估骨骼肌生长和发育的关键工具。在本研究中，当日粮NFC/NDF比例为1.82时，检测到最佳的骨骼肌生长，表现为紧密组织的纤维、最小的肌间间隙和增加的肌纤维横截面积。这表明日粮能量来源的适当平衡对于骨骼肌生长和发育至关重要。一种可能的解释是，NFC（例如淀粉）是瘤胃微生物发酵的主要能量来源，而NDF（例如纤维素）在促进瘤胃结构发育中起关键作用。当NFC与NDF的比例平衡时，有足够的底物用于瘤胃微生物生长和充分的瘤胃发育。此外，通过瘤胃发酵产生的营养物质（如挥发性脂肪酸）可以被宿主吸收，为骨骼肌和其他组织的生长提供能量和原料。本研究的结果支持这一假设。值得注意的是，我们还观察到，随着日粮NFC/NDF比例的降低，肌肉组织学参数下降，导致纤维密度降低、纤维直径变小和肌间间隙增加。这表明低量的日粮NFC可能限制骨骼肌组织的合成代谢活动，损害正常生长。这突出了平衡日粮能量来源的重要性。反刍动物骨骼肌的生长和发育是一个复杂的生物学过程，不仅受营养因素的影响，还受遗传背景、内分泌调节和体力活动的影响。因此，阐明日粮能量来源与骨骼肌生长之间的内在关系需要整合分子生物学、生物化学和其他学科的研究，并随后在更大的反刍动物群体中进行验证。

为了进一步研究营养因素对骨骼肌生长和发育的调控作用，我们系统地分析了藏绵羊骨骼肌的表观遗传景观。我们采用了一种新的整合方法，结合ATAC-seq和H3K27ac CUT&Tag来解码饮食诱导肌肉发育的复杂机制。我们的研究结果揭示了一个涉及肌肉祖细胞调控的全面表观遗传轨迹，产生了一个创新框架，以识别在不同NFC/NDF比例下驱动肌肉特异性基因表达模式的关键调控元件。据我们所知，这项研究首次对藏绵羊饮食诱导的肌肉发育进行了全面的表观基因组分析，为营养干预诱导的肌肉可塑性的基本机制提供了宝贵的见解，并为家畜肌肉生物学研究提供了宝贵的资源。

这项研究产生了高质量的测序数据，ATAC-seq文库的测序深度为50 M，CUT&Tag文库的测序深度为30 M，大大超过了ENCODE标准，提供了足够的测序深度。通过peak calling，识别出60,000–110,000个CUT&Tag peaks和70,000–80,000个ATAC peaks，表明藏绵羊肌肉基因组中存在大量潜在的顺式调控元件，这与哺乳动物基因组的调控特征一致。大量的peaks为探索藏绵羊肌肉发育的调控机制提供了丰富的候选位点。最后，应用IDR方法筛选具有高组内一致性的peaks，有效消除了噪声信号和批次效应。结果，获得了30,000–60,000个高置信度的CUT&Tag peaks和40,000–50,000个高置信度的ATAC peaks，为后续分析提供了坚实的数据库。

值得注意的是，ATAC-Seq和H3K27ac CUT&Tag peaks的全基因组分布模式被发现是相似的，两组peaks主要位于基因组的非编码区域。先前的研究表明，54%的人类ATAC-seq peaks位于远离启动子的区域，突出了远端调控在基因调控中的普遍性和重要性。这些非编码区域富含转录因子结合位点和组蛋白修饰，它们在细胞特异性基因表达中起着至关重要的作用。在本研究中